正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表达的探讨

1、正常人周围血初始和记忆 T 细胞亚群及细胞因子表 达的探讨 【关键词】 初始和记忆 T细胞;,T 细胞亚群;, 细胞表面标志 ;, 细胞 因子 Subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells in normal human PBMCsAbstract AIM: To determine subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells by polychromatic flow cytometry （PFC）. METHODS:

2、PBMCs were separated from normal human peripheral blood and stimulated by superantigen （SEB）. After incubation for 5 hours, the cells were fixed, permeablized and stained with multiplecolorlabeled mAbs for cell surface and intracellular cytokines. Then they were detected by polychromatic flow cytome

3、try and the data were analyzed by Flow Jo software. RESULTS: Based on the expression of CD45RO molecules, CD4+ and CD8+ T cells were classified as nave and memory cells, which were further devided into several subsets according to the expression of CD62L and CCR7. When PBMCs were stimulated by SEB f

4、or 5 hours, CD45RO+ and CD45RO-CD4+ or CD8+ T cells expressed IL2, IFN and TNF . Further analysis indicated that CD62LloCCR7lo and CCR7+ T cells but not CD62Lhi and CD62LhiCCR7+ T cells expressed cytokines. In addition, the percentage of cytokine expression in CD62Llo CCR7lo subsets was markedly hig

5、her than that in CCR7+ subsets. CONCLUSION: It is not scientific to identify nave and memory cells in human T cells only based on the expression of CD45RO. Accurate determination of nave, effector and memory cell populations can be achieved not only based on the expression of CD45RO but also accordi

6、ng to the expression of CD62L. Keywordsnave memory T cells; T cell subset; cell surface marker; cytokine 摘 要 目的 : 利用多色流式 检测技术探讨初始和记忆 T 细胞亚群与细胞因子表达之间的关系。方法 : 自正 常人静脉血中分离 PBMC, 经超抗原（ SEB）刺激 5 h 后, 加入多种抗细胞表面 标记和抗细胞因子抗体进行染色 , 利用流式细胞术检测 , 并利用 Flow Jo 软件 分析结果。结果 : 根据 CD45RO表达与否, 将CD4+和 CD8+ T细胞分为初始和记 忆 T

7、细胞 ,再根据归巢受体（ CD62L）和趋化因子受体（ CCR）7 的表达 与否, 将初始和记忆 T 细胞进一步分为不同的亚群。当 T 细胞受到 SEB激活后 , CD45RO和+ CD45RO的- CD4+或CD8+ T细胞均表达 IL2、 IFN 和TNF。进一 步分析结果表明 , CD62Lhi 和 CD62LhiCCR7细+胞不表达细胞因子 , 而 CD62LloCCR7lo和 CCR7+ T细胞均表达细胞因子 , 其中 CD62LloCCR7lo细胞表 达细胞因子的阳性率明显高于 CCR7细+ 胞亚群。结论 : 只利用 CD45RO表达与否 区分初始和记忆 T 细胞是不够准确的 ,

8、同时检测 CD62L的表达 , 可明显地提高 其准确性。关键词初始和记忆 T细胞; T 细胞亚群; 细胞表面标志 ; 细 胞因子 人周围血 T细胞主要是由 CD4+和 CD8+ T细胞所组成 , 根据 其表型、 功能和不同的组织分布 , 将 T 细胞分为许多亚群 1-3 。传统的鉴别 初始和记忆 T细胞的方法 , 是根据 CD45RO或CD45RA的表达与否 : CD45RO-或 CD45RA者+ 为初始 T细胞, 反之为记忆 T细胞。在记忆 T细胞中, 根据归巢受体 CD62L和趋化因子受体 CCR7的表达与否 , 又可将记忆 T 细胞分为中央型 （TCM）和效应型（ TEM）细胞 4-7

9、。目前 , 利用多色流式细胞仪检测技术 （ polychromatic flow cytometry, PFC）结合多种抗体标记同时染色法 , 可将 周围血 T细胞进一步分为几十甚至上百个亚群 2, 3 。对这些微小细胞亚群的 探讨 , 将进一步揭示免疫功能在生理和病理的情况下的变化。本研究中利用 PFC技术同时结合多种抗体进行细胞表面标记和细胞内细胞因子的检测, 探讨 了细胞亚群和细胞因子产生之间的关系 , 该研究将为基础和临床研究奠定基 础。 1 材料和方法 1.1 材料 Cy7PE标记的抗 CD3单克隆抗体 （mAb）、 Q605标记的抗 CD4 mAb、 Cy5.5APC标记的抗 CD

10、8 mAb、 Cy7APC标 记的抗 CD45RO mA、b Cas B 标记的抗 CCR7 mA、b Q705标记的抗 CD62L mA、b PE标记的抗 IL2 mAb、 APC标记的抗 IFN mAb和 FITC 标记的抗 TNF mAb, 购自 BD/Pharmingen 公司或由美国国立卫生研究院惠赠。 SEB及皂素 （saponin ）购自 Sigma公司。 RPMI1640培养液和 Hanks缓冲液购自 GIBCO 公司。流式细胞检测仪为 BD公司产品。1.2 方法 1.2.1 人外周血 单个核细胞（ PBMC）的分离 抽取健康志愿者静脉血 , 肝素抗凝 , 以 Hanks 缓冲

11、液等体积稀释后 , 用 Ficoll 进行密度梯度离心（于 22 2000 r/min 离心 20 min ）获取 PBMC。充分洗涤后 , 用 RPMI1640 完全培养液调整 PBMC的密度为 2109/L 。1.2.2 细胞染色 细胞染色按照常规染色方法进行操作。 （1）细胞表面分子的检测 : 简言之 , 取细胞悬液 100 L, 加入标记的抗细胞 表面特异性抗原的抗体 , 于4避光反应 30 min, 洗涤 2 次（1 800 r/min 离 心 8 min ）。（ 2）细胞内细胞因子的染色 : 将待测细胞用 PBS洗涤 2 次后 , 加 入细胞固定液室温固定 7 min, 洗涤 2

12、次。然后加入 200 L 含有通透剂 （saponin ）的缓冲液作用 2 h, 再加入特异性的胞内标记的 mAb, 于 4避光 反应30 min, 洗涤 2次。以 300 L染色缓冲液重悬细胞 , 应用流式细胞术检 测细胞, 并用 Flow Jo 软件分析流式细胞术检测结果。 2 结果 2.1 初始和记忆 T细胞亚群的表型特征正常人 PBMC中 CD3+ T细胞（图 1A）是由 CD4+（图 1B）和 CD8+（图 1C）T细胞所组成。根据 CD45RO的表达与否 , 可将 CD4+ T细胞分为 CD4+CD45RO和+CD4+CD45RO两-个细胞亚群 （图 1B）; 同样 可将 CD8+

13、 T细胞分为 CD8+CD45RO和+CD8+CD45RO细-胞亚群（图 1C）。这些细胞 亚群代表着初始 T细胞（ CD45RO）- 和记忆 T细胞（ CD45RO）+。再根据归巢受 体（ CD62L）和趋化因子受体（ CCR7）的表达与否 , 可将初始 CD4+ T细胞（图 1E）、 记忆CD4+ T细胞（图1D）、 初始 CD8+ T细胞（图1G）和记忆 CD8+ T细胞 （图1F）进一步分为 4个不同的细胞亚群。从图 1D、 E、 F 和G中可以看出, 初始和记忆 T细胞 CD62L和 CCR7的表达存在着明显的差异。百事通 2.2 初始和记忆 T 细胞细胞因子的表达 为了进一步探讨初

14、始和记忆 T 细胞 的表型和功能之间的关系 , 利用超抗原（SEB）短暂（ 5 h）刺激 PBMC后, 观察初 始（图2A、 C）和记忆（图 2A、 B）CD4+ T细胞中 IL2、 IFN 和TNF的表达 以及相互之间的关系。结果表明 , 记忆 CD4+ T细胞（图2B）中 IL2、 IFN和 TNF的表达明显高于初始 CD4+ T细胞（图2C）。同样地, 当初始（图3A、 C） 和记忆（图3A、 B）CD8+ T细胞经 SEB刺激后, 其细胞因子表达的结果与 CD4+ T细胞表达的结果相似。此外 , 不论是初始还是记忆 T细胞, 在 SEB刺激后 , 其中的部分细胞同时产生一种或多种细胞因

15、子。图 1 图 3 略 2.3 初始和记忆 CD4+ T细胞亚群中细胞因子的表达初始 CD4+ T细胞 , 根 据CD62L和CCR7的表达与否 , 可以分为 4个亚群（图4A）, 即 CD62L+、 CD62L+CCR7、+ CD62L-CCR7-、 CCR7+细胞。深入分析这 4 个细胞亚群细胞因子 产生的结果表明 , CD62L+（图4B）和CD62L+CCR7+图（ 4C）亚群基本不表达 IL2 和 IFN, CD62L- CCR7-亚群（图4D）中有7.61%的细胞只表达 IL2, 5.41% 的细 胞同时表达 IL2 和 IFN, 6.02% 的细胞只表达 IFN; 而在 CCR7

16、亚+ 群（ 图 4E） 中, 6.93%的细胞只表达 IL2, 同时表达 IL2 和IFN或只表达 IFN的细胞的 百分率较低 , 分别为 0.21%和 1.06%。同样地 , 从分析 CD4+CD45RO细+胞亚群 （图 5A）的细胞因子表达的结果中 , 获得与上述相类似的结果。 CD62L+（图 5B）和 CD62L+CCR7+图（ 5C）细胞亚群基本不表达细胞因子 , 而 CD62L-CCR7亚- 群（ 图 5D） 中, 只表达 IL2 的细胞为 11.60%, 同时表达 IL2 和 IFN 的细胞为 7.06%, 只 表达IFN的细胞为 4.15%; 在CD62L-CCR7亚+群（图5

17、E）中, 只表达 IL2 的细 胞为 13.20%, 同时表达 IL2 和 IFN 的细胞为 2.41%, 只表达 IFN 的细胞为 3.58%。图 4 略 2.4 初始和记忆 CD8+ T细胞亚群细胞因子的表 达 初始 CD8+ T细胞, 根据 CD62L和 CCR7的表达与否 , 可以分为 4 个亚群 （图6A）, 即CD62L+、 CD62L+/CCR7、+ CD62L-CCR7、- CCR7+细胞。进一步分 析这 4种细胞亚群细胞因子的表达 , 结果表明 , CD62L+（图 6B）和 CD62L+CCR7+图（ 6C）亚群基本不表达 IL2 和IFN。在CD62L-CCR7亚- 群（

18、图 6D） 中, 有极少数细胞（ 0.48%）只表达 IL2, 5.82% 的细胞同时表达 IL2 和IFN, 16.30%的细胞只表达 IFN。 在 CCR7+亚群（图 6E）中, 1.01 的细胞只表达 IL2, 0.58% 的细胞同时表达 IL2 和 IFN, 3.61% 的细胞只表达 IFN。 同样地, 从分析 CD8+CD45RO细+胞亚群（图 7A）细胞因子表达的结果中 , 也获得与上述相 类似的结果。 CD62L+（图 7B）和 CD62L+CCR7+图（ 7C）细胞亚群基本不表达 IL2 和 IFN, 在 CD62L-CCR7-亚群（图 7D）中, 1.87 的细胞只表达 IL

19、2, 6.66% 的细 胞同时表达 IL2 和 IFN, 13.17 的细胞只表达 IFN。在 CCR7亚+ 群（ 图 7E） 中, 2.30%的细胞只表达 IL2, 1.42% 的细胞同时表达 IL2 和IFN, 7.08%的细 胞只表达 IFN。图 5 图 7 略 3 讨论 我们利用多种染色流 式细胞术同时结合多种标记抗体染色技术 , 对正常人 CD4+和 CD8+ T细胞亚群 进行了分析。其结果与文献 6 和我们以前报道 1 的结果相一致。 CD4+和 CD8+ T细胞可分为 CD45RO+和 CD45RO亚- 群, 而这些亚群又可进一步分为 CD62L+、 CD62L+CCR7、+ C

20、D62L-CCR7-以及 CCR7细+ 胞亚群 , 证明正常人外周血 T细胞表 型的多样性1, 6, 7 。目前, 根据细胞表面标记的不同 , 可以将 T细胞分为几 十或上百个细胞亚群 2, 3 。传统上 , 只利用 CD45RO或 CD45RA的表达与否来 鉴别初始和记忆 T 细胞。事实上 , 初始和记忆 T 细胞除了表型不同外 , 其细胞 因子的产生和功能亦存在着不同 3, 8 。为此, 我们在以前研究的基础上 , 本 研究又利用超抗原（ SEB）刺激 PBMC, 探讨了细胞表型与细胞因子产生之间的 关系。结果表明 , 只利用单一的细胞表面标记 CD45RO的表达与否 , 不能完全区 分正

21、常人 PBMC中的初始和记忆 T细胞。从试验结果中可以看出 , 当 PBMC经 SEB刺激后, CD45RO+和 CD45RO的- CD4+或 CD8+ T细胞均表达 IL2、 IFN和 TNF, 这些结果与文献 3 报道的结果相一致。众所周知 , SEB可激活 PBMC中 5%20%的T细胞, 将其与 PBMC孵育45 h 后, 可诱导效应/记忆T细胞而不 能诱导初始 T细胞表达细胞因子 , 说明 SEB是一种十分有效的多克隆 T 细胞激 活剂。细胞因子 IFN 和 TNF 被认为是效应因子 , 直接发挥着免疫效应的功 能; 而 IL2 被认为是细胞存活因子 , 参与维持记忆 T 细胞的存活

22、。在单个细胞 水平分析的结果表明 , 这 3 种细胞因子可由同一个细胞或不同细胞产生 , 说明 了 T 细胞亚群功能的多样性。结合表型和细胞因子分析的结果表明 , 正常人 PBMC中 T 细胞不论在表面标记还是细胞因子的表达上均存在着多样性。从本研 究的结果可以看出 , 只根据 CD45RO的表达与否不能准确地区分初始和记忆 T 细 胞, 但与 CD45RO细- 胞相比 , CD45RO+的 CD4+和CD8+ T细胞中表达 IL2、 IFN 和 TNF 细胞的百分率都明显增加。此外 , 不论 CD45RO的表达与否 , CD62L-CCR7以- 及 CCR7+细胞均高表达 IL2 和/或 I

23、FN, 表明效应型和中央型记 忆 T 细胞之间的差异 3, 6 。综上所述 , 正常人 PBMC中的 T 细胞是由表型和功 能不同的细胞群体组成。了解不同的细胞亚群 , 特别是抗原特异性 T 细胞亚群 的数量和功能 , 对于疾病的诊断、 疾病预后的判断以及疫苗的设计和效果的评 价, 均具有重要的指导意义。参考文献 :1 吴长有, 刘 杰. 利用 多种表面标志鉴别正常人周围血初始和记忆 T 细胞亚群 J. 免疫学杂志 , 2006, 22（ 2）: 120-123.2 Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M. Seventeencolour flow cytometry: unrave