蛋白质药物的分析

1、1 第十章第十章 氨基酸与蛋白质类药物的分析氨基酸与蛋白质类药物的分析 第一节第一节 概述概述 第二节第二节 氨基酸类药物的分析氨基酸类药物的分析 第三节第三节 蛋白质类药物的分析蛋白质类药物的分析 2 第一节第一节 概述概述 v一、氨基酸的性质一、氨基酸的性质 v二、蛋白质的性质二、蛋白质的性质 3 一、氨基酸的性质一、氨基酸的性质 v具有具有旋光性旋光性 v光吸收光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外 区有最大吸收。区有最大吸收。 v酸碱性酸碱性：两性电解质，净电荷为零时的：两性电解质，净电荷为零时的pH称为等称为等 电点（电点（pI ），）， 生理

2、条件下多数以负离子形式存在生理条件下多数以负离子形式存在 pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI 净电荷为负净电荷为负 CH R COOH NH3+ CH R COO NH2 CH R COO NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- (pK 1)(pK 2) 当氨基酸溶液在某一定当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负值时，使某特定氨基酸分子上所带正负 电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此 时溶液的时溶液的pH值即为该氨基酸的值即为该氨基酸的等电点等电点(isoelectr

3、ic point，pI)。 1.1.两性解离和等电点两性解离和等电点 一、氨基酸的性质一、氨基酸的性质 Trp Tyr Phe 的的 紫紫 外外 吸吸 收收 光光 谱谱 摩尔吸收系数摩尔吸收系数 波长波长 2.2.光学性质光学性质 a. a. 与茚三酮反应与茚三酮反应: :用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定. . b.b.与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)反应反应(sanger(sanger反应反应):): 用于蛋白质用于蛋白质N-N-端测定端测定。 c. c. 与苯异硫氰酯（与苯异硫氰酯（PITCPITC）反应）反应(Edman(Edman反应反应)

4、)， 用于蛋白用于蛋白N-N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理 依据。依据。 3.3.重要化学反应重要化学反应 氨基酸与茚三酮反应氨基酸与茚三酮反应 + 3H20 水合茚三酮水合茚三酮(无色无色) NH3 CO2 RCHO + 还原性茚三酮还原性茚三酮 紫色化合物紫色化合物 (弱酸弱酸) 加热加热 水合茚三酮水合茚三酮 + 2NH3 + 还原性茚三酮还原性茚三酮 氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反应的反应 （sangersanger反应）反应） DNFB（dinitrofiuorobenzene） DNP-AA(黄色

5、黄色) + + HF 弱硷中弱硷中 氨基酸氨基酸 氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应）的反应 （EdmanEdman反应）反应） PITC（phenylisothiocyanate） + 苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） 弱硷中弱硷中 (400 C) (硝基甲烷硝基甲烷 400 C) H+ 二、蛋白质的性质二、蛋白质的性质 v蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相连形成的相连形成的 高分子含氮化合物

6、高分子含氮化合物。 2.1蛋白质为什么能作为药物蛋白质为什么能作为药物? 1）作为生物催化剂（酶）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用）代谢调节作用(胰岛素调节血糖胰岛素调节血糖) 3）免疫保护作用）免疫保护作用(白介素和干扰素白介素和干扰素) 4）物质的转运和存储）物质的转运和存储 5）运动与支持作用）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递 2.2 蛋白质元素组成的特点：蛋白质元素组成的特点： v各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。 v100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量 ( g % )= 每克样每克样 品含氮克数品含氮克数

7、6.25100 2.3 蛋白质的基本单位蛋白质的基本单位-氨基酸氨基酸 氨基酸的分类：氨基酸的分类： v非极性側链氨基酸非极性側链氨基酸 v非电离极性側链氨基酸非电离极性側链氨基酸 v酸性氨基酸酸性氨基酸 v碱性氨基酸碱性氨基酸 14 2.4 蛋白质的性质蛋白质的性质 n 高分子有机物高分子有机物 n 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 n 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点 n 蛋白质的紫外吸收特性蛋白质的紫外吸收特性 n 蛋白质呈色反应蛋白质呈色反应 15 蛋白质为高分子有机物蛋白质为高分子有机物 v蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，还蛋白质水溶液具有亲水胶体的性质，还 具有扩散和具有扩散和

8、沉降沉降作用，粘度大和不透过作用，粘度大和不透过 半透膜半透膜等。等。 v沉降常数（沉降常数（S）：）： v扩散常数（扩散常数（D）：）： v粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质粘度：在一定溶质浓度下，取决于溶质 的分子量和形状。的分子量和形状。 16 蛋白质为两性电解质蛋白质为两性电解质 v蛋白质分子至少具有一个自由氨基和蛋白质分子至少具有一个自由氨基和 一个自由羧基，具有一个自由羧基，具有两性解离性质两性解离性质。 v蛋白质电泳、离子交换。蛋白质电泳、离子交换。 蛋白质主要呈色反应蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应双缩脲反应 酚试剂反应酚试剂反应 蛋白质定量、定性蛋白质定量、定性 茚三酮反应茚三

9、酮反应 测定常用方法测定常用方法 18 双缩脲反应双缩脲反应 v双缩脲试剂的成分双缩脲试剂的成分: :碱性硫酸铜溶液。碱性硫酸铜溶液。 v碱性溶液中，碱性溶液中，双缩脲双缩脲( (H H2 2NOCNOCNHNHCONHCONH2 2) )能与能与 CuCu2+ 2+作用，形成紫色或紫红色的络合物。 作用，形成紫色或紫红色的络合物。 19 Folin 酚反应（酚反应（Lowry） v 包括两步反应：包括两步反应： v（1）在碱性条件下，与铜试剂作用生成）在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋蛋 白质铜络合物白质铜络合物； v（2）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，）此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，

10、 生成深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量生成深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量 成正相关。成正相关。 v660nm测定，灵敏度比双缩脲法高测定，灵敏度比双缩脲法高100倍。倍。 适于微量蛋白的测定。适于微量蛋白的测定。 蛋白质的紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光蛋白质在远紫外光 区（区（200-230nm200-230nm）有较）有较 大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有 一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用 这一特性对蛋白质进行这一特性对蛋白质进行 定性定量鉴定。定性定量鉴定。 蛋白质质量浓度蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm

11、280 260 测定范围：测定范围：0.10.5mg/ml 21 第二节第二节 氨基酸类药物的分析氨基酸类药物的分析 v一、氨基酸鉴别一、氨基酸鉴别 v二、氨基酸定量二、氨基酸定量 22 一、氨基酸鉴别一、氨基酸鉴别 v茚三酮茚三酮：溶液均显蓝紫色。：溶液均显蓝紫色。 v旋光性旋光性： v薄层色谱鉴别法薄层色谱鉴别法 ： v紫外光谱鉴别紫外光谱鉴别：酪氨酸、色氨：酪氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸，在紫外区有最酸、苯丙氨酸，在紫外区有最 大吸收。大吸收。 v红外光谱鉴别红外光谱鉴别：压制成溴化钾：压制成溴化钾 片，在片，在4000667 cm-1范围内范围内 测定吸收图谱。测定吸收图谱。 23 二、氨

12、基酸定量二、氨基酸定量 v（一）（一）茚三酮法茚三酮法 v（二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 v（三）铜复合物紫外吸收法（三）铜复合物紫外吸收法 v（四）（四）甲醛滴定法甲醛滴定法 v（五）（五）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v（六）（六）双波长分光光度法双波长分光光度法 v（七）（七）导数分光光度法导数分光光度法 v（八）（八） HPLCHPLC法法 24 （一）茚三酮法（一）茚三酮法 v茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化茚三酮在酸性条件下和氨基酸反应，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳，分解生成醛，放出氨和二氧化碳，还原型茚三酮还原型茚三酮。 v还原型茚三酮与氨及另

13、一分子茚三酮缩合生成蓝紫还原型茚三酮与氨及另一分子茚三酮缩合生成蓝紫 色的物质，最大吸收值波长色的物质，最大吸收值波长570 nm。 v范围：范围：0.5-50g 25 （二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 vTNBS在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先 形成形成中间络合物中间络合物。 v酸性溶液中，中间络合物转化成酸性溶液中，中间络合物转化成TNB-氨基氨基 酸酸，吸收值移至，吸收值移至340nm处。处。 26 （三）铜复合物紫外吸收法（三）铜复合物紫外吸收法 v在合适的在合适的pH条件下，二分子条件下，二分子-氨基酸与一分子氨基酸与一分子 铜离子形成铜离子形

14、成氨基酸氨基酸-铜复合物铜复合物。 v复合物呈蓝色，除了在复合物呈蓝色，除了在620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在 230nm有最大吸收有最大吸收 v蛋白质水解速度和蛋白质水解速度和水解程度水解程度的测定。的测定。 27 （四）甲醛滴定法（四）甲醛滴定法 v在在pH中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结中性下，甲醛迅速与氨基酸上的氨基结 合，使平衡合，使平衡向右移动向右移动，促进氢离子释放，使，促进氢离子释放，使 溶液酸度增加。溶液酸度增加。 v每释放出一个氢离子，相当有一个每释放出一个氢离子，相当有一个氨基氮。氨基氮。 28 （五）非水溶液滴定法（五）非水溶液滴定法 v非水溶液滴定法：是氨基酸

15、在非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中冰醋酸中用用高高 氯酸的标准溶液氯酸的标准溶液滴定其含量。滴定其含量。 v酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为 酸，能接受质子的物质为碱。酸，能接受质子的物质为碱。 v弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在，而弱酸在 碱性溶剂中酸性显得更强。碱性溶剂中酸性显得更强。 v适合适合成品成品测定，测定范围是几十毫克。测定，测定范围是几十毫克。 29 非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v直接滴定法直接滴定法：适用于能：适用于能溶于溶于冰醋酸的氨基冰醋酸的氨基 酸。丙氨酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、酸。丙氨

16、酸、精氨酸、组氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸等。 v回滴法回滴法：适用于不能：适用于不能溶于冰醋酸而能溶于溶于冰醋酸而能溶于 高氯酸高氯酸的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱的氨基酸。赖氨酸、丝氨酸、半胱 氨酸等。氨酸等。 30 （六）（六）双波长分光光度法双波长分光光度法 v消除共存组分干扰消除共存组分干扰 v等吸收波长的选择等吸收波长的选择:复方氨基酸复方氨基酸 注射液在注射液在320280 nm范围内，范围内， 只有只有色氨酸和酪氨酸色氨酸和酪氨酸有吸收度。有吸收度。 v酪氨酸在酪氨酸在280，303.2波长处吸波长处吸 收度相等，收度相等，选用选用280

17、与与303.2nm 为等吸收波长为等吸收波长。 31 标准曲线的绘制标准曲线的绘制 v精密吸取精密吸取1.2，2.0，3.0，4.0，5.0， 6.0ml色氨酸对照品色氨酸对照品溶液，置溶液，置100 ml 量瓶中，用氢氧化钠液稀释至刻度，量瓶中，用氢氧化钠液稀释至刻度， 在在280，303.2nm处分别测定，计算处分别测定，计算 吸收度差值吸收度差值A 。 v在在0.53.0mg/100ml范围，范围，浓度与吸浓度与吸 收度差值呈良好性关系收度差值呈良好性关系。 32 （七）、（七）、导数分光光度法导数分光光度法 v选定导数光谱波长范围为选定导数光谱波长范围为322270nm，按导数分光按导数分光 光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三阶导光度法测定色氨酸、酪氨酸的一阶，二阶和三阶导 数光谱。数光谱。 v在在三阶导数光谱三阶导数光谱中色氨酸在中色氨酸在287、284、280nm有三有三 个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶导数个导数光谱峰，而酪氨酸在零线上，选定三阶导数 分光光度法。分光光度法。 33 标准曲线绘制标准曲线绘制 v对照品对照品色氨酸色