westernblotting蛋白质印迹实验的流程

1、实用标准文案细胞总蛋白的提取(1) 离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少星上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用lxPBS溶液洗涤2次，每次加入ImL PBS溶液,1000r/min , 4。(2离心5min , 弃上层液体。洗涤两次后，将上清液丸全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬(若不分散， 则无法与裂解液充分混匀L(2 )每管加入细胞团等体积的含蛋白醃抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液;如需检测隣酸化 蛋白，则需另加入隣酸酶抑制剂。使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30mino如暂不提 取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸

2、酶抑制列的lx PBS约100 pL , 1000r/min , 4C离心5min后，主全弃上层液体，置于-80C冰箱保存备用。(3 )冰上超声处理细胞,每次超声2s，间隔3s ,约10-20次。(4 ) 13000r/min , 4C离心15min ,收集上清港液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于 -80C冰箱保存备用。2. BCA法测走蛋白质浓度(1 )配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足呈BCA工 作液，充分混匀，置于常温备用。(2) 配制标准品取原标准品BSA ( 2mg/mL )约lOOpL ,取出50pL ,用ddH2O按对数法稀

3、释成如下浓度：lmg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL ;设置 96 孑版第F排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20pL lxPBS ,从第三横排起，精彩文档.实用标准文案按浓康梯度由低到高依次取20pL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。(3 )稀释待测样品取5pl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50pL ,分别取20pL至96孑板中，每一浓度做 2个平行孔；(4 )分别加入200pL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气 泡，置于溫箱37C孵育30mino(5)将96孔板取出后用酶标仪测走

4、OD570nm值。(6 )根据标准品的OD570nm值绘制标准曲线，并根据标准曲线计算得到待测样品的蛋白质浓 度蛋白质变性(1)根据预计将要上样的蛋白质样品质呈(25Mg-50pgpg ,是蛋白质而走),取适呈体积的蛋 白质样品于预冷的EP管中，加入5xSDS上样缓冲液(体积约为蛋白质样品休积的25%),通 过调节上样缓冲液的体积将各样品混合液的终体积调节至相仿。用封口膜将离心管封口, 7000r/min离心点离样品混合液3s ,使其混合均匀。(2 )将放置样品混合液的架子置于盛有适呈dd H2O的磁盘中，用电磁炉加温至100C ,煮沸5min0点离样品，使冥混合均匀。2.34.54. SDS

5、-PAGE 分离蛋白质 根据将要检测的蛋白质大小.首先确走配制10%的分离胶（10ml ）:dd H2O4ml精彩文档.实用标准文案30?r-Bis3.3mll.OMTris-HCI ( pH8.8 )2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.005ml将配置好的液体吹打混匀r灌胶，再用注射器将dd H2O缓憬均匀的加于分离胶上层，待胶凝 固后（光下可见明显的水胶分离线）将上层水倒掉，并用滤纸尽呈将水吸干（注意不要碰到分离 胶X然后配制4%浓缩胶（3ml ）:dd H2O1.8ml30?r-Bis0.4mll.OMTris-HCI ( pH6.8 )0.76ml10%S

6、DS0.03ml10%AP0.03mlTEMED0.003ml将配置好的液体吹打混匀后r迅速灌胶并马上插入梳齿,待胶充分凝固后放入垂直电泳槽内,加入电泳缓冲液刖心将梳齿拔出，每孔加入等质星变性蛋白质（根据不同的蛋白质具体的上样质 呈会有所变化，但相同蛋白质的上样质量始终不变）后进行电泳。先采用80V恒压电泳约30min 后，改用100V恒压电泳约2h (具体视溟酚蓝跑到胶的最底端的时间而走L 2.34.6转膜(1砸先裁剪出大小适宜的PVDF膜和滤纸,尽呈使PVDF膜面积稍大于凝胶，但不大于海绵。将彩文档.实用标准文案(2) 电泳结束后，将凝胶剥下,小心的将浓缩胶切除,将分离胶浸泡于预冷的转移缓

7、冲液中约 15min ,洗去杂质。(3) 将PVDF膜丸全浸泡在甲醇中约30s。(4) 在倒满转移缓冲液的塑料盘中依次加入转膜用的夹子(正极一侧在下,保持水平 一块 海绵垫、滤纸、浸泡好的PVDF膜、浸泡好的凝胶、滤纸和另一块海绵垫，整个操作过程中要 不断赶走气泡，在夹紧夹子前要确认各层中没有气泡(否则会影响转膜结果X(5) 将夹子放入电泳转移槽中，确认夹子的正负极与转移槽正负极相对，整个转移槽埋在冰中 进行转膜。根据将要检测的蛋白质分子星大小确走转膜时间/分子蛋白一般为恒压80V ,1.5h ; 大分子蛋白一般为恒压100v, 2h0(6 )转膜结束后打开夹子，小心去除负极一端的海绵、滤纸和

8、胶，在PVDF膜的右上角剪一个 角以确走正面，然后取出，根据预染蛋白Marker标准判断转膜效果及目的条带的大致位置。2.34.7免疫反应(1 )封闭：将PVDF膜浸泡于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中(如要检测磷酸化蛋白，则需 使用含5%BSA的PBST封闭液进行封闭)，室溫下揺床摇动封闭约l-2h。(2 )剪膜：依据预染蛋白Marker标准判断目的蛋白的条芾位置，并将其小心剪下，膜的竟度 应适当，并尽星保留周围可能出现条帝的位置。(3 ) 一抗孵育:用5%BSA溶液将一抗稀释至适宜浓度,并加入到大小合适的孵育槽中，将剪 好的PVDF膜置于冥中，稀释好的一抗应当至少没过PVDF膜。4C下摇床

9、摇动封闭过夜。(4 )洗膜：室溫下，用1 x PBST 缽床上洗涤PVDF膜4次，每次lOmin.辅彩文档.实用标准文案(5 )二抗孵育:根据一抗选择相应的羊抗鼠IgG二抗或羊抗兔IgG二抗，用含5%脱脂奶粉的 PBST将辣根过氧化物醃标记的二抗稀释至适宜浓度，并加入到大小合适的孵育植中，将PVDF 膜置于槽中，室温下摇床摇动孵育2h0(6 )洗膜：室溫下,用PBST 嗨床上洗涤PVDF膜3次，每次lOmin.2.34.8显影(1 )用水冲洗好平板，将保鲜膜平整的铺于平板上,并用滤纸赶走气泡，将孵育好的PVDF膜 取出置于保鲜膜上，放置整齐，并用滤纸轻轻吸去PVDF膜上的液休；(2 )取适星E

10、CL试剂A、B液等体积混合后滴于PVDF膜上，避光孵育5min ,用滤纸吸去剩 余的发光试剂，并将平板放入凝胶扫痫成像系统中，根据荧光强度确走曝光时间(5s-30min L 待成像后将图片以tif格式保存。(3 )用灰度分析软件Quantity One软件对实验结果进行灰度扫描。2.4 5 HDAC组蛋白去乙酰化酶活性比色分析试剂盒检测HDAC活性 (1)取对照组和实验组各50pg待测蛋白质样品，用ddH2O将其稀释，使终体积为85pl ,并按OpM f 1.25pM r 25pM, 5.0pM浓度依次加入96孔酶标板中。(2 )加入 10pl lOxHDAC Assay Buffer0(3

11、)再加入 5pl HD AC Colorimetric Substrate ,彻底混匀。(4 )在温箱中37C孵育lh0(5 )加入10pl Lysine Developer并彻底混匀f终止反应。(6 )在温箱中37C孵育30minc精彩文档.实用标准文案(7 )将96孔板取出后用酶标仪测走A450 OD450nm值。将其转化为酶的活性值并进行统计 学分析。2.5细胞周期及凋亡率检测(1) 收集实验组和各个对照组K562细胞5x106个，1000r/min ,4C离心5min，弃去上清。(2) 1xPBS洗涤细胞两次,1000r/mi n , FC离心5min ,丸全弃去上清。用手指轻弹细胞团， 使具分散重悬