第九章-维生素的测定

1、1 第九章 维生素的测定 第一节第一节 概概 述述 第二节第二节 脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的测定 第三节第三节 水溶性维生素的测定水溶性维生素的测定 2 一、维生素的故事 人类对维生素的认识始于人类对维生素的认识始于3000多年前。当时古埃多年前。当时古埃 及人发现及人发现夜盲症夜盲症可以被一些食物治愈，虽然他们可以被一些食物治愈，虽然他们 并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人 类对类对维生素维生素最朦胧的认识。最朦胧的认识。 第一节第一节 概述概述 1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南

2、美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床 破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船 到达目的地时，原来的到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有多人，活下来的只有35 人，人们对此找不出原因。人，人们对此找不出原因。 3 1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重 的的坏血病坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛 弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥野草充饥，

3、几天后，几天后 他的坏血病竟不治而愈了。他的坏血病竟不治而愈了。 诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万英国水手的生命。诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万英国水手的生命。 1747年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军 和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的意建被和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的意建被 采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬柠檬中的中的 什么物质对坏血病有抵抗作用。什么物质对坏血病有抵抗作用。 第一节第一节 概述概述 4 1912年，波兰科学家丰克，经过千百次的试验，年，波兰科

4、学家丰克，经过千百次的试验， 终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色 物质。这种物质被丰克称为物质。这种物质被丰克称为 “维持生命的营养素维持生命的营养素 ”，简称，简称Vitamin(维他命），也称维生素维他命），也称维生素。 随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们 认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它 们排列起来以便于记忆，们排列起来以便于记忆，维生素按维生素按A、B、C一直一直 排列到排列到L、P、U等几十种。等几十种。 第一节第一节 概述概述 5

5、维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类 天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30 余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关 重要的有重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质余种。这些维生素结构复杂，理化性质 及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类， 有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。 维生素的结构复杂：维生素的结构复杂： 分为：分为： 胺类（胺类（B1） 醛类

6、（醛类（B6） 醇类（醇类（A） 酚酚 醌类等醌类等 6 维生素的命名 l多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生 素素A、维生素、维生素B1、B2，维，维 生生 素素C， 维生素维生素E等。等。 l根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸 、生育酚等、生育酚等。 l按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸 等。等。 7 维生素都具有以下共同特点：维生素都具有以下共同特点： u化合物或其前体化合物都在化合物或其前体化合物都在天然食物天然食物中存在；中存在； u不能

7、供给机体热能不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，也不是构成组织的基本原料， 主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要 量极小；量极小； u一般一般在体内不能合成在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，或合成量不能满足生理需要 必须经常从食物中摄取；必须经常从食物中摄取； u长期缺乏长期缺乏任何一种维生素都会任何一种维生素都会导致相应的疾病导致相应的疾病。 8 维生素维生素A缺乏时的具体表现为：缺乏时的具体表现为： 影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至 夜盲。夜盲。 皮肤干燥

8、、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。皮肤干燥、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。 免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。 头发干枯、易断，指甲无光泽。头发干枯、易断，指甲无光泽。 牙质萎缩，骨骼发育不良。牙质萎缩，骨骼发育不良。 味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。 影响智力发育。影响智力发育。 9 测定食品中维生素含量的意义测定食品中维生素含量的意义 评价食品的营养价值评价食品的营养价值； 寻找富含维生素的食品资源寻找富含维生素的食品资源； 指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生指导人们合理调整膳食结构，防止维生

9、素缺乏症或维生 素中毒素中毒； 研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指 导人们制定合理的加工工艺及贮存条件导人们制定合理的加工工艺及贮存条件； 监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引 起维生素中毒起维生素中毒。 10 脂溶性维生素脂溶性维生素 ：溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂 类共存的一类维生素，包括类共存的一类维生素，包括A、D、E、K 各小类，各小类， 其共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从其共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从 尿中排除

10、，大剂量摄入时可能引起中毒；由于可储尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；由于可储 藏在脂肪中，藏在脂肪中，故不需每天供给故不需每天供给。 水溶性维生素水溶性维生素 ：溶于水，包括溶于水，包括B、C 各小类，各小类，其共其共 同特点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织同特点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织 需要后都能从机体排出。需要后都能从机体排出。需要每天供给。需要每天供给。 维生素的分类维生素的分类 11 维生素的分析方法维生素的分析方法 测定方法优点缺点 生物鉴定法不用详尽分离 费时（21天）费力（ 要动物饲料） 微生物法 选择性高，主要用于 水溶性V 操作繁琐，耗时过长 ，要有专

11、门人员 仪器分析（紫外法； 荧光法） 灵敏、快速、有较好 的选择性 各种色谱法（柱、纸 、薄层层析） 高分离效能，可分离 、纯人、定性、定量 现代高压液相色谱和 气相色谱 可同时完成多种V及其 异构体的自动分离、 检测 化学分析法（比色法 简便、快速、不需特 殊仪器） 12 第二节第二节 脂溶性脂溶性V的测定的测定 VA、 、VD、VE、与类脂类物质一起存于食物中， 与类脂类物质一起存于食物中， 摄食时可吸收，可在体内积贮。摄食时可吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质：脂溶性维生素具有以下理化性质： 1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于 脂肪

12、、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2耐酸碱性：维生素耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对酸不稳定， 对碱对碱 稳定，维生素稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在对碱不稳定，但在抗氧化剂存在 下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。 13 3耐热性、耐氧化性：耐热性、耐氧化性： 耐热性耐热性 氧化性氧化性 VA 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 易被氧化易被氧化 （光、热（光、热 促进其氧化）促进其氧化） V D 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 不易被氧化不易被氧化 V E 好，能经受煮沸好，能经受煮沸 在空气

13、中能慢慢被化在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其（光、热、碱促进其 氧化）氧化） 14 根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常： 皂化皂化样品样品 水洗去除类脂物水洗去除类脂物 有机溶剂有机溶剂 提取脂溶性维生素提取脂溶性维生素(不皂化物不皂化物) 浓缩浓缩 溶于适当的溶剂溶于适当的溶剂 测定。测定。 在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解， 常加入常加入抗氧化剂抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素如焦性没食子酸、维生素C等等)。 对于对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的共存的样品，或杂质含量高的 样品，在皂化提取后

14、，还需进行层析分离。样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。 15 国际单位：国际单位： IU （International Unit) 1 IU = 0.3g VA = 0.025 VD = 1.79 g-胡萝卜素胡萝卜素 = 1.1mg - VE = 3 g VB 一、维生素一、维生素A的测定的测定 维生素维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于存在于动物性脂肪中，主要来源于 肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植 物性食品中不含物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜，但在深色果蔬中含有胡萝卜 素，它在人体内可转变为素，它在人体内可转变为VA

15、，故称为，故称为VA原。原。 16 17 维生素维生素A的性质的性质 因有许多不饱和链，故见光易分解；因有许多不饱和链，故见光易分解； 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。 对碱稳定。对碱稳定。 CH3 CH3 CH2OR CH3CH3 CH3 18 目前维生素目前维生素A都是合成的，来源：都是合成的，来源： （1）从动物肝脏中得到；）从动物肝脏中得到； （2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡 萝卜素，主要是萝卜素，主要是-胡萝卜素）胡萝卜素） 维生素维生素A的测定常用的方法有的测定常用的方法有:

16、 三氯化锑比色法三氯化锑比色法 紫外分光光度法紫外分光光度法 荧光分析法荧光分析法 液相色谱法。液相色谱法。 19 比色法测定比色法测定VA的含量的含量 （GB/T 5009.822003中第二法）中第二法） （一）（一） 原理原理 在氯仿溶液中，在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性与三氯化锑可生成蓝色可溶性 络合物，在络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光波长处有最大吸收峰，其吸光 度与度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测的含量在一定的范围内成正比，故可比色测 定。定。 20 （二）适用范围及特点（二）适用范围及特点 本法适用于维生素本法适用于维生素A含量较高

17、的各种样品含量较高的各种样品(高高 于于 510gg)，对低含量样品，因受其他脂溶性，对低含量样品，因受其他脂溶性 物质的干扰。不易比色测定。物质的干扰。不易比色测定。 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定 性差。比色测定必须在性差。比色测定必须在 ，否则蓝色，否则蓝色 会迅速消退，将造成极大误差。会迅速消退，将造成极大误差。 6秒钟内完成秒钟内完成 21 2.仪器仪器 实验室常用设备实验室常用设备 分光光度计分光光度计 回流冷凝装置回流冷凝装置 3.试剂试剂 本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水 （1）

18、无水硫酸钠无水硫酸钠 Na2SO4 （2） 乙酸酐乙酸酐 （3） 乙醚乙醚 （不含有过氧化物）（不含有过氧化物） （4） 无水乙醇无水乙醇 （不含有醛类物质）（不含有醛类物质） （5） 三氯甲烷三氯甲烷 （不含分解物，否则会破坏维生（不含分解物，否则会破坏维生 素素A ） 22 检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生 成氯化氢。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使成氯化氢。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使 氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说 明

19、三氯甲烷中有分解产物。明三氯甲烷中有分解产物。 （6） 25%三氯化锑三氯化锑-三氯甲烷溶液三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制用三氯甲烷配制25%三氯三氯 化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分）化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分） （7） 50%氢氧化钾溶液（氢氧化钾溶液（KOH） W/V （8） 维生素维生素A标准液标准液 视黄醇（纯度视黄醇（纯度85% Sigma）用脱醛乙）用脱醛乙 醇溶解维生素醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为标准品，使其浓度大约为1ml相当于相当于1mg视黄视黄 醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。 （9） 酚酞指

20、示剂酚酞指示剂 用用95%乙醇配制乙醇配制1%溶液溶液 23 4. 4. 操作步骤操作步骤 维生素维生素A A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。 4.14.1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。 (1)(1)皂化法：皂化法： 皂化皂化：根据样品中维生素：根据样品中维生素A A含量的不同，称取含量的不同，称取0.5g0.5g5g5g 样品于三角瓶中，加入样品于三角瓶中，加入202040mL40mL无水乙醇及无水乙醇及10mL50%10mL50%氢氢 氧化钾，于电热板上回流氧化钾，于电热板上回

21、流30min30min至皂化完全为止。（至皂化完全为止。（皂皂 化法化法适用于适用于维生素维生素A A含量不高的样品含量不高的样品，可减少脂溶性物，可减少脂溶性物 质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A A 损失）损失） 24 提取提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以 30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣 子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙乙 醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分

22、液漏斗中。振摇 并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液 漏斗内。皂化瓶再用约漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗乙醚分二次冲洗，洗 液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层， 水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。 重复至水液中无维生素重复至水液中无维生素A为止。为止。 25 洗涤洗涤： 用约用约30mL水水加入第一个分液漏斗中，轻轻振加入第一个分液漏斗中，轻轻振 摇，静置片刻后，放去水层。加摇，静置片刻后，放去水层。加15 20mL 0.5mol

23、/L氢氧化钾氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，液于分液漏斗中，轻轻振摇后， 弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水水涤，涤， 每次用水约每次用水约30mL，直至洗涤液，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无与酚酞指示剂呈无 色为止色为止（大约洗涤（大约洗涤3次）。醚层液静置次）。醚层液静置1020min， 小心放出析出的水。小心放出析出的水。 26 浓缩浓缩： 将醚层液经过将醚层液经过无水硫酸无水硫酸钠滤入三角瓶中，再钠滤入三角瓶中，再 用约用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液 并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中并

24、入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中 剩约剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加 入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜含量在适宜 浓度范围内。浓度范围内。 27 (2)研磨法：研磨法： 研磨研磨：精确称：精确称25g样品，放入盛有样品，放入盛有35倍样品重量的无倍样品重量的无 水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。 （研磨法适用于每克样品维生素研磨法适用于每克样品维生素A含量大于含量大于510g样品的样品的 测定测定，如肝样品的分析。步

25、骤简单，省时，结果准确），如肝样品的分析。步骤简单，省时，结果准确） 提取提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准 确加入确加入50100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品，使样品 中维生素中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需12h），或），或 离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装 乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中）。乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中）。 浓缩浓缩：取澄清提取乙醚液：取澄清提取乙醚液2

26、5mL，放入比色管中，在，放入比色管中，在 7080水浴上抽气蒸干。立即加入水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。三氯甲烷溶解残渣。 28 29 4.24.2标准曲线的制备标准曲线的制备: : 准确取一定量的维生素准确取一定量的维生素A A标准液于标准液于4 45 5个容量个容量 瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比 色管顺次取色管顺次取1mL1mL三氯甲烷和标准系列使用液三氯甲烷和标准系列使用液1mL1mL，各，各 管加入管加入乙酸酐乙酸酐1 1滴滴，制成标准比色系列。于，制成标准比色系列。于620nm620nm波波 长处，以三氯

27、甲烷调节吸光度至零点，将其标准比长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比 色列按顺序移入光路前，迅速加入色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL9mL三氯化锑三氯化锑- -三三 氯甲烷溶液。于氯甲烷溶液。于6 6秒内秒内测定吸光度，将吸光度为纵测定吸光度，将吸光度为纵 坐标，以维生素坐标，以维生素A A含量为横坐标绘制标准曲线图。含量为横坐标绘制标准曲线图。 30 4.3样品测定样品测定: 于一比色管中加入于一比色管中加入10mL三氯甲三氯甲 烷，加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加烷，加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加 入入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入三氯甲烷，其余比色管中分别

28、加入1mL样样 品溶液及品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制 备备。 注意：注意： 维生素维生素A见光易分解，整个实验应在见光易分解，整个实验应在暗处暗处进进 行，防止阳光照射，或采用行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃棕色玻璃避光。避光。 2. 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇 水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用稀盐酸稀盐酸浸浸 泡后再清洗。泡后再清洗。 31 说明：说明： 1，本法为国家标准方法，适用于食品中维生素，本法为国家标准方法，适用于食品中维生素 的测定。的测

29、定。 2，乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象，在，乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象，在 提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳 化，可加几滴乙醇消除乳化。化，可加几滴乙醇消除乳化。 3，所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会，所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会 出现深沉，干扰比色测定。故在每出现深沉，干扰比色测定。故在每1mL氯仿中应氯仿中应 加入乙酸酐滴，以保证脱水。加入乙酸酐滴，以保证脱水。 32 ，由于三氯化锑与维生素所产生的蓝色物质很，由于三氯化锑与维生素所产生的蓝色物质很 不稳定，通常不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求

30、反应在以后便开始褪色，因此要求反应在 比色皿中进行，产生蓝色后立即读取吸光度值。比色皿中进行，产生蓝色后立即读取吸光度值。 5，如果样品中含，如果样品中含胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等 食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶 解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱 剂进行柱层析。剂进行柱层析。 33 二、维生素二、维生素D的测定的测定 维生素维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又 称钙化醇，是类固醇的衍生物，是一类关系钙、磷称钙化醇，是类固醇的

31、衍生物，是一类关系钙、磷 代谢的活性物质。具有维生素代谢的活性物质。具有维生素D活性的化合物约有活性的化合物约有 10种，其中最重要的是维生素种，其中最重要的是维生素D2、维生素、维生素D3及其及其 维生素维生素D原。维生素原。维生素D2无天然存在，维生素无天然存在，维生素D3只存只存 在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原原 (麦角固醇和麦角固醇和7一脱氢胆固醇一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。经紫外线照射形成。 维生素维生素D2 药片吃多了中毒。药片吃多了中毒。 34 分析方法中较好的是分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱比色法和高效液相色谱

32、法法。 (一一)三氯化锑比色法三氯化锑比色法 (二二) 高效液相色谱法高效液相色谱法 它的灵敏度较比色法高它的灵敏度较比色法高30倍以上，且操倍以上，且操 作作 简便，精度高，分析速度快。是目前分简便，精度高，分析速度快。是目前分 析维生素析维生素D的最好方法。的最好方法。 35 三氯化锑比色法三氯化锑比色法 原理原理 在三氯甲烷溶液中，维生素在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯与三氯 化锑结合生成一种黄色化合物，呈色化锑结合生成一种黄色化合物，呈色 强度与维生素强度与维生素D含量呈正比。含量呈正比。 食品中维生素食品中维生素D含量较低，其他维生含量较低，其他维生 素严重干扰其测定，因此测定前必须

33、素严重干扰其测定，因此测定前必须 经柱层析除去干扰成分。层析介质为经柱层析除去干扰成分。层析介质为 硅藻土、中性氧化铝硅藻土、中性氧化铝 洗脱液洗脱液 样品样品 填充物填充物 分部收集分部收集 玻璃柱玻璃柱 36 说明说明 1，食品中维生素，食品中维生素D的含量一般很低，而维生素的含量一般很低，而维生素A、 维生素维生素E、胆固醇、甾醇等成分的含量往往大大、胆固醇、甾醇等成分的含量往往大大 超过维生素的含量，严重干扰维生素的测超过维生素的含量，严重干扰维生素的测 定，因此测定前必须经定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分柱层析除去这些干扰成分。 ，此法不能区分维生素，此法不能区分维生素2和

34、维生素和维生素3，测定，测定 值为两者的总量。值为两者的总量。 37 水溶性维生素包括：水溶性维生素包括： 维生素维生素B1(硫胺素硫胺素) 维生素维生素B2（核黄素）（核黄素） 维生素维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺） 维生素维生素PP（烟酸）（烟酸） 叶酸、泛酸（维生素叶酸、泛酸（维生素B3） 生物素（维生素生物素（维生素B7） 维生素维生素C 等，等， 38 特点：特点： u 水溶性维生素都易溶于水水溶性维生素都易溶于水, u 不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。 u 在在酸性介质酸性介质中中很稳定很稳定，即使加热也不破

35、坏；，即使加热也不破坏； u 但在碱性介质中不稳定，但在碱性介质中不稳定，特别在特别在碱性条件下加热碱性条件下加热，可大，可大 部或全部破坏部或全部破坏。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影 响响 。 广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形 式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。 维生素维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏； 维生素维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化对氧、铜离子敏感，易被

36、氧化。 39 根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般根据上述性质，测定水溶性维生素时，一般 都在都在酸性溶液酸性溶液中进行前处理。中进行前处理。 维生素维生素Bl、B2 盐酸水解盐酸水解 酶解酶解 提取提取 纯化纯化 维生素维生素C通常采用草酸、草酸通常采用草酸、草酸醋酸、偏磷醋酸、偏磷 酸酸醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质 中，可以消除某些还原性杂质对维生素中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏的破坏 作用。作用。草酸草酸价廉，使用方便，对维生素价廉，使用方便，对维生素C有很好有很好 的稳定作用。的稳定作用。 淀粉酶、淀粉酶、 木瓜蛋白酶木瓜蛋

37、白酶 活性人造浮石、活性人造浮石、 硅镁吸附剂硅镁吸附剂 40 一一、维生素、维生素B1的测定的测定 维生素维生素B1又名硫胺素、抗神经炎素，通常以又名硫胺素、抗神经炎素，通常以 游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵 母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛 乳、蛋黄中含量较为丰富。乳、蛋黄中含量较为丰富。 分析方法：分析方法：GB/T 5009.842003中唯一的方中唯一的方 法是法是荧光计法荧光计法。 41 荧光法荧光法 原理原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被

38、氧化成 一种兰色荧光物质，即为硫色素，一种兰色荧光物质，即为硫色素，在给定的条件在给定的条件 下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫下，以及没有其他物质干扰时，此荧光强度与硫 色素含量成正比色素含量成正比。 荧光测定条件：荧光测定条件： 激发波长激发波长 365nm；狭缝；狭缝 5nm. 发射波长发射波长 435nm；狭缝；狭缝 5nm. 一一、维生素、维生素B1的测定的测定 42 维生素维生素B 2的测定的测定 维生素维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或即核黄素。在食品中以游离形式或 磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各 种动物性食品，

39、其中以肝、肾、心、蛋、奶含量种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量 最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。 分析方法：分析方法：GB/T 5009.852003中第一法为中第一法为 荧光法。第二法为微生物法。荧光法。第二法为微生物法。 43 原理原理 核黄素在核黄素在440500nm波长光照射下发生黄绿色荧波长光照射下发生黄绿色荧 光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在光，在稀溶液中，荧光强度与核黄素浓度成正比。在 波长波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸 钠钠(连二亚硫酸钠连二亚硫

40、酸钠 Na2S2O4),将核黄素还原成无荧光的将核黄素还原成无荧光的 物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度， 两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。 44 维生素维生素B 6的测定的测定微生物法微生物法 原理：微生物的生长与它们对某些原理：微生物的生长与它们对某些特定的维生素特定的维生素的的 需求有关，因此在维生素分析中，将某些微生物在需求有关，因此在维生素分析中，将某些微生物在 含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知含维生素的样品抽提液中的生长速率，与在含已知 量维生素对照溶液中的生长速

41、率进行对比，从而得量维生素对照溶液中的生长速率进行对比，从而得 出样品中该维生素的含量。生长速率可通过测定浊出样品中该维生素的含量。生长速率可通过测定浊 度、产酸量、质量变化或呼吸作用，测定度、产酸量、质量变化或呼吸作用，测定浊度浊度是最是最 常用的方法。维生素常用的方法。维生素B6的含量在的含量在2ng/mL以内，其以内，其 浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关浓度对卡尔斯伯酵母菌的生长速率有良好的线性关 系，可以定量测定。系，可以定量测定。 45 二、维生素二、维生素C的测定的测定 维生素维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的 作用，所以又称作抗坏血酸

42、。维生素作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在广泛存在 于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、 辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含 量尤为丰富。量尤为丰富。 46 O O OH OH HOCH CH2OH OO O HOCH O CH2OH OHO O O H HOH CH2OH OH 氧化氧化 氧化氧化 还原型抗坏血酸还原型抗坏血酸 脱氢抗坏血酸脱氢抗坏血酸 2，3二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸 三、维生素三、维生素C的测定的测定 维生素维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产具有较强的还原性

43、，对光敏感，氧化后的产 物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则 生成生成2，3 -二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的 所谓所谓总抗坏血酸总抗坏血酸是指是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，的总量， 不包括不包括2，3 -二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。 47 VC检测技术 2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法 简便/须脱色、干扰多（深色、其他还原性物质） 二甲苯二氯靛酚比色法二甲苯二氯靛酚比色法 深色 荧光法：准确度高，较复杂 2

44、,4-二硝基苯肼法 还原还原 型型VCVC 的测的测 定定 总总V VC C 的测定的测定 总总VC=VC=氧化型氧化型VC+VC+还原型还原型VC+VC+二酮古乐糖酸二酮古乐糖酸 少少 氧化氧化+ +还原还原+ +二酮古二酮古 乐糖酸乐糖酸 操作复杂，结果易受影响操作复杂，结果易受影响 氧化型氧化型+ +还原型还原型 48 1原理原理 还原型抗坏血酸可以还原染料还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。二氯靛酚。 该染料在酸性溶液中呈粉红色该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶在中性或碱性溶 液中呈蓝色液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。，被还原后颜色消失。 还原型抗坏血酸还原染料后，本身

45、被氧化成还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成 脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样 品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血 酸含量成正比。酸含量成正比。 （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc* 49 O OH OH H OHH CH2OH O + O N ClCl OH O O O H OH O H CH2OH + O ClCl N OH H 还原型还原型Vc 染料（显色）染料（显色） 氧化型氧化型Vc 被还原的染料（不显色）被还原的染料（不显色） （一）（一）2，6-二

46、氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 50 2. 试剂试剂 2%草酸溶液：称草酸溶液：称20g草酸，加水至草酸，加水至1000mL； 维生素维生素C标准液：准确称标准液：准确称20mgVC溶于溶于1%草酸中，并稀释至草酸中，并稀释至 100mL，吸，吸5mL于于50ml容量瓶中，加入容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此草酸至刻度，此 溶液每毫升含有溶液每毫升含有0.02mgVC； 0.02%2，6-二氯靛酚溶液二氯靛酚溶液：称取：称取2，6-二氯靛酚二氯靛酚50mg，溶于，溶于 200mL含有含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至 250mL，过滤于棕色

47、瓶中，贮存于冰箱内，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每应用过程中每 星期标定一次。星期标定一次。 （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 51 0.001N KIO3标液：吸标液：吸0.1N KIO3溶液溶液5ml于于 500ml容量瓶内容量瓶内加水至刻度，每毫升相当加水至刻度，每毫升相当VC 0.008mg 0.5%淀粉溶液；淀粉溶液； 6%KI溶液。溶液。 52 标定一：吸标液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml 加2%草酸溶液10ml 加1%淀粉3滴用KIO3标液滴定到 淡兰色。 计算： 抗坏血酸浓度（mg/ml）=c V1 88/ V2 c-

48、 KIO3标液的浓度（mol/L） V1 - 滴定时消耗KIO3标液的体积（ml） V2 -维生素C溶液量 （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 53 标定二：吸5ml已知浓度V C标液 加5ml1%草酸 用染料 2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终 点 计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于 滴定度（T） T= （C V1）/ V2 C - 维生素C的浓度（mg/ml） V1 -维生素C的体积（ml） V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml） （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 54 （一）（一）2

49、，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 测定过程测定过程 A. 样品处理样品处理 新鲜果蔬样品新鲜果蔬样品：称取鲜样：称取鲜样50.0100.0g，放入组织捣碎机，放入组织捣碎机 的杯中加入等重量的的杯中加入等重量的2%草酸提取液，快速捣碎草酸提取液，快速捣碎1分钟，将分钟，将 样品打成浆状。样品处理的整个过程应在样品打成浆状。样品处理的整个过程应在10分钟内完成，分钟内完成， 以免以免VC被空气氧化。被空气氧化。 用小烧杯称取浆状物用小烧杯称取浆状物10.030.0 g（含还原性（含还原性VC 15 mg） ，放入，放入100mL容量瓶中，用容量瓶中，用2%草酸溶液定容，若有泡沫

50、草酸溶液定容，若有泡沫 可加可加2滴辛醇除去。滴辛醇除去。 过滤过滤，如果滤液颜色深，影响滴定终点的判定时，可加入，如果滤液颜色深，影响滴定终点的判定时，可加入 12勺白陶土脱色，不易过滤，可用离心机分离。勺白陶土脱色，不易过滤，可用离心机分离。 55 多汁果蔬样品多汁果蔬样品：可用纱布压汁后脱脂棉花快速过滤，量取：可用纱布压汁后脱脂棉花快速过滤，量取 1020mL汁液，立即用汁液，立即用2%草酸溶液定容至草酸溶液定容至100mL容量瓶中容量瓶中 干样品干样品：称取：称取1.0004.000 g（含还原性（含还原性Vc 15mg），放），放 入研钵中，加入少许入研钵中，加入少许2%草酸溶液研磨

51、成浆状液，洗入草酸溶液研磨成浆状液，洗入 100mL容量瓶中，用容量瓶中，用20g/L草酸溶液定容。草酸溶液定容。 含有还原性物质含有还原性物质的样品：含有的样品：含有较多较多Fe2+的样品可用的样品可用8% 醋酸醋酸 代替用代替用2%草酸溶液作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可于稀释草酸溶液作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可于稀释 至一定容量之前加入至一定容量之前加入20mL丙酮丙酮，以，以除去除去SO2的干扰的干扰。 （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 56 B B 滴定：滴定：吸取以上制备的无色滤液吸取以上制备的无色滤液5.0010mL（含（含Vc约约0.2 1mg）

52、放入）放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的2 ，6-二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在15秒内不褪色秒内不褪色 为终点为终点, 同时以浸提剂作为空白（空白值为同时以浸提剂作为空白（空白值为0.080.10 mL） 进行滴定。进行滴定。 计算：计算： VcVc（mg/100gmg/100g )=(VV0) T/m100 式中：式中：x样品中还原型抗坏血酸含量，样品中还原型抗坏血酸含量，mg/100g； V滴定时样液消耗染料的体积，滴定时样液消耗染料的体积，mL； V0空白滴定时消耗染料的体积，空白滴定时消耗染料的体积，

53、mL； T用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出1mL 染染 料溶液相当于抗坏血酸的量，料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL； m滴定时所取滤液中含有样品的质量，滴定时所取滤液中含有样品的质量，g （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 57 注意事项注意事项: : 所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；所有试剂的配制最好都用重蒸馏水； 滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜 色变化的参考；色变化的参考； 样品进入实验室后，应浸泡在已知量的样品进入实验室后，应浸泡

54、在已知量的2%2%草酸液中，以防氧草酸液中，以防氧 化，损失维生素化，损失维生素C C；2%2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而 1%1%草酸无此作用；草酸无此作用； 贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（FeFe2+ 2+）， ）， 要用要用8%8%的醋酸代替的醋酸代替2%2%草酸草酸。这时如用草酸，。这时如用草酸，低铁离子可以还原低铁离子可以还原 2 2，6-6-二氯靛酚二氯靛酚，使测定数字，使测定数字增高增高，使用醋酸可以避免这种情，使用醋酸可以避免这种情 况的发生；况的发生； （一）（一）2，6-二氯

55、靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 58 整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；滴整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；滴 定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后定开始时，染料溶液应迅速加入直至红色不立即消失，而后 尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色尽可能一滴一滴地加入，并不断摇动三角瓶，至粉红色15s 内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较内不消失为止。样品中某些杂质还可以还原染料，但速度较 慢，故滴定终点以出现红色慢，故滴定终点以出现红色15s 不褪色为终点。滴定时，可不褪色为终点。滴定时，可 同时吸二个样品。一个滴定，另

56、一个作为观察颜色变化的参同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参 考考 在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消 除；除； 测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积 。 （一）（一）2，6-二氯靛酚滴定法二氯靛酚滴定法还原性还原性Vc 59 (二二)荧光法荧光法（GB/T 5009.86-2003 第一法第一法） 原理原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢脱氢 型抗坏血酸型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成具有后，与邻苯二胺反应生成具有荧光荧光的喹的喹 喔啉。在一定条件下，喹喔啉的荧光强度与脱氢抗喔啉。在一定条件下，喹喔啉的荧光强度与脱氢抗 坏血酸的浓度成正比，以此坏血酸的浓度成正比，以此测定食物中抗坏血酸和测定食物中抗坏血酸和 脱氢抗坏血酸的总量脱氢抗坏血酸的总量。 一定条件：一定条件：激发光：激发光：338nm 发射光：发射光：420nm 60 （三三）2，4-二硝基苯肼法二硝基苯肼法- Vc总量总量 GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法 总抗坏血酸包括：总抗坏血酸包括： 还原型还原型 脱氢型脱氢