乳酸菌菌种的分离筛选办法

1、乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏 阳性菌，无芽抱，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形 成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、 乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽抱乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、 MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培 养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌

2、属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径 o.6i.o卩m在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生， 单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRSS养基上菌落小，呈白色。 沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。 分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分 细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈， 作为分离鉴别的依据，通过对生成

3、的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸， 维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红 柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸 菌无害。 一. 筛选方法： 1. 溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含 CaC03勺培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可 用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入 CaC03勺作用是：鉴别能产生酸的细菌；中和产生的酸，以维持培养基的 PH 筛选过程：样品预处理一梯度稀释至10-6一选择合适的稀释度涂布一 37 C培养48h-挑选产生溶 钙圈的菌落反复在 MRS培养基上划线一挑起单

4、菌落染色，经镜检确认为纯种一挑选革兰氏阳性单 菌落一试管穿刺4C冰箱保存 2. 溴甲酚绿指示剂法： 培养基： MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液） 筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 二. 菌种的分离筛选 1. 培养基： 1.1麦芽汁碳酸钙培养基：麦芽汁（10BX 1L预先灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分离用） 1.2 牛肉 膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵 母 膏 10g/L 番茄汁 200g/L 葡萄 糖 10g/L 吐 温 0.05%CaC0315-20g/L溴甲酚绿 0.01%PH6.0-6.5 （分离用） 1.3 番茄汁碳酸钙培养基： 酵

5、母膏 7.5g/L 葡萄糖 10g/L 番茄汁 100mL蛋白胨 7.5g/LKH2PO42.0 g/L 吐温 0.5mLPH6.0-6.5 （分 离用） 1.4 葡萄糖 20g/L 酵母膏 10g/LPH6.0-6.5 1.5 蛋白胨 8-10g/L 酵母膏 3-5g/L 葡萄糖 13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/L MgSO40.3-0.5g/LMnSO40.2-0.25g/LNaAC3.0-5.0g/LPH5.5-6.5 1.6 蛋白胨 0.8-1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆 0.5-1.0g/L KH2PO40.1-0.3g/LMgS

6、O40.3-0.5g/LNaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5 （发酵或种子培 养基） 1.7MRS9养基（分离培养计数用） 蛋白胨 10.0g 、牛肉膏 10.0g 、酵母膏 5.0g 、柠檬酸氢二铵 2.0g 、 葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼 脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5。（分离培 养基），当 MRSt养基冷却至4550C时，加入已灭菌的碳 酸钙, 充分混匀 , 倒平板。 1.8BCP 培 养基 （ 溴甲酚紫培养基 ） 乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5 %溴甲

7、酚紫10ml自来水1000mlpH6.5-7.0 （分离用） 1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g,溶于50ml水中，加入1.6 %溴甲酚绿酒 精溶液0.07ml , 0.075Mpa20mh另取琼脂2.0 g,溶于50ml水中，加酵母膏 1.0 g溶解后调pH6.5-6.8 , 0.1 Mpa20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37 C培养24h,检查是否有杂菌。 2. 分离筛选： 2.1富集培养：取1.0g （1.0 ml）于无菌细口瓶中，加入无菌 麦芽汁液体培养液于瓶口处，密闭， 25-32 C培养48h。若培养基表内出现绢丝波纹物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸

8、菌。以 同样方法转接2-3次，接种量3-5 % . 2.2 菌种分离纯化： 溶钙圈法： 富集菌液或样品适当稀释至10-7，混菌法分离，先加入10-12mlMRSt养基？或麦芽汁培养基，凝固 后再注入4-5ml水琼脂培养基，制成厌氧环境，30E或37C培养2-3天（温度低时间稍长），可出 现针头状或圆形稍扁菌落，周围形成透明圈。挑取透明圈大，培养基变黄的菌落，反复划线纯化 2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于 MRS9养基培养后保存备用。或接入液 体培养基中，25-32 C培养24-48h，然后穿刺于MR培养基或麦芽汁碳酸钙半固体培养基中，25-32 C 培养 48h 保存备用

9、。 2.3 性能测定： 乳酸菌定性试验： 不同条件下的产酸速率试验：将分离菌种接种于MRSS体培养基中25C 37C温度下培养测不同菌 株不同温度的 pH。 方法1.吸取发酵液10ml，注入空试管中，加入10%硫酸1.0ml，在加入2.0 %高锰酸钾约 1.0ml ，此时乳酸转化成乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银 溶液中浸湿，横搭在试管口上，将试管徐徐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳 酸生成。 方法 2. 纸层析法：展开剂为正丁醇：甲醇：水 =80： 15： 5，毛细血管吸取发酵液，多次点样于新 华滤纸上，1.5 %标准乳酸为对照，平衡2小时后进行层析，3%溴甲酚蓝显色计算 R

10、f值。 产酸量测定：5.0 ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l 氢氧化钠滴定至微红色。 醋酸量（g/100mL）二氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100 同时，进行单因素试验，分别考察醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择 优势菌株。 3. 菌株鉴定： 3.1 菌落形态： 3.2 菌体形态：（革兰氏染色观察）染色镜检：杆状阳性。 3.3 乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法 3.4 生理生化： 乳酸菌产酸能力曲线：将筛选的乳酸菌接种于 MRS体培养基中，25-32 C培养48h,间隔4-6h测 定发

11、酵液 pH。 食盐对乳酸菌的影响：在 MRS体培养基中，添加0.0 % 2.0 % 4.0 % 6.0 %氯化钠，菌种分别接种 于培养基中，32E培养48h,测定OD值。 溴甲酚绿指示剂法： 原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分离培养基配制后PH为6.8，加 入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落周围变成黄色，较容易鉴别。 培养基： BCG乳营养琼脂 初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培养，平板上出现扁平的黄色菌落及周围培养基也为黄色初 定为乳酸菌。 复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰 氏染色阳性，连续传代若干次培养，挑选出3

12、-4h能凝固的乳管保存备用。 注： 1. 乳酸菌筛选常在几种培养基同时进行： 分别在麦芽汁碳酸钙培养基，番茄汁碳酸钙培养基，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）同时进行混菌 划线或涂布培养（放厌氧袋），分别 25T 37C培养48h。 菌落观察：平板表面形成浅色（黄色或白色）小菌落。麦芽汁碳酸钙培养基表面，菌落周围形成透 明圈，BCP培养基（溴甲酚紫培养基）周围使紫色的培养基形成黄色包围圈。 触酶反应：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0 %过氧化氢于菌落上，若无气泡产 生，证明该菌为触酶阴性。 将各种特征菌落分别接入斜面，培养后保存，进一步生理生化试验，以鉴定分别何种乳酸菌。 2. 菌

13、落鉴定：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。 2.1 菌落形态观察：乳白色边缘不整齐，稍呈半球状凸起，实心菌落。 个体形态：半透明细杆状链状排列，大量时呈发丝状堆积。初步认为乳杆菌。 2.2 生化鉴定：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反应。说明该菌不具有分解色氨 酸产生吲哚的能力。明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。 （过氧化氢酶 还原硝酸盐） 糖发酵试验： 发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反应， 其余麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴 性反应。根据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。 （纤维二糖甘露醇山梨醇七 叶苷水杨苷） 2.3 乳酸菌生长曲线 pH-t 测定结果： 三. 几种乳酸菌筛选举例 1. 嗜热链球菌：样品来源：市售酸奶培养基：M17改良培养基，培养温度：42C，需氧情况：兼性 厌氧，筛选方法：常规的稀释涂布和划线分离 2. 保加利亚乳杆菌： 样品来源：