抗BP5―BSA多克隆抗体的制备及鉴定

1、 抗BPBSA多克隆抗体的制备及鉴定 法氏囊活性五肽 （ Bursopentin ，BP5） 是从法氏囊中分离 所得的一种活性小肽，氨基酸序列为 CKDVY （ Cys-Lys-Asp-Val-Tyr ）。多克隆抗体是采用传统的免疫方法， 将抗原物质经不同的途径注入动物体内， 经数次免疫后采取动物 血液，分离出血清，获得的抗血清。本研究以间接 ELISA 测定兔 抗BP5-BSA多抗血清的抗体效价并分离纯化动物血清， 使之能大 批量生产制备， 多克隆抗体在实验动物生产的主要意义是获得高 滴度实验或高亲和力的抗血清， 用于实验或诊断测试， 为进一步 研究法氏囊BP5小肽在体内分布奠定实验基础，

2、并为新型疫苗佐 剂的研究开发奠定基础。 一、材料与方法 1. 实验材料 2 只雄性家兔（约 2 公斤重）购于洛阳市塔湾村养殖户；将 BS5与BSA偶联制备免成疫原，委托上海科肽生物科技 XX公司 生产。 2. 实验动物免疫 将2只家兔分为A对照组、B实验组两组。A组用PBS溶液 进行免疫，B组用抗原（BP5-BSA进行免疫，待家兔适应两天 后进行首次免疫，首免14 d后进行二次免疫，二次免疫 14 d后 进行三次免疫。 3. 兔抗BP5-BSA多抗血清采集 首免第 7 d ，第 14 d ，二免第 7 d ，二免第 14 d 分别对 A， B两组的家兔耳缘静脉采血 1 mL/只。37C恒温箱内

3、放置3h后， 置于台式离心机中，以 4000r/min的速度离心6min，吸取血清 于EP管中，做好标记，于-20C冰箱中保存备用。家兔三免后第 7 d，对A、B两组的家兔进行心脏采血，分离出动物血清，保存 于-20C冰箱中备用。 4. 兔抗BP5-BSA多抗血清的抗体含量变化 用间接ELISA的方法分别测出兔抗 BP5-BSA多抗血清7 d , 14 d , 21 d , 28 d、35 d在450 nm的波长下各孔的吸光度（OD 值。 5. 硫酸铵盐析法测兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG的含量 取1 mL血清于试管中，加入1 mL生理盐水，混匀，然后于 搅拌下逐滴加入 2 mL 饱和硫酸

4、铵溶液，此时硫酸铵溶液的终饱 和度为溶液 50%。室温下， 放置 20 min， 3000 r/min 离心 10 min， 弃去上清液，用 1 mL 的生理盐水将沉淀溶解，再逐滴加入硫酸 铵溶液0.5 mL,此时硫酸铵溶液的终饱和度为 33%室温下，放 置20 min，重复上述第二步过程12次，末次离心后所得沉淀 为蛋白质。在最终沉淀物中加入 5 mL生理盐水做5倍稀释。再 从稀释品中取1 mL,加9 mL生理盐水做10倍稀释，最终所沉 淀的蛋白质的稀释度50,分光光度计上读出 OD直，用生理盐水 调零。 蛋白含量(mg/mL = (1.45 X OD280 0.74 X OD260 X 稀

5、？ 度 二、结果与分析 1. 兔抗BP5-BSA多克隆抗体效价动态变化 采集免疫家兔第7 d，第14 d，第21 d，第28 d，第35d 的血液， 经离心后取其血清， 用间接 ELISA 的方法在酶标仪检测 其在 450 nm 的吸光度值。在酶标仪上对酶标板进行检测，所读 的OD450直变化如图1所示，家兔BP5-BSA多克隆抗体的量随免 疫天数的增多而逐渐增加，首免后的 2 周多克隆的含量较少， 而二免后的2周家兔BP5-BSA多克隆抗体的产生速率增加，大 约是首免后的二倍。 对照组多克隆抗体的量则基本没有变化。 实 验组与对照组相比较说明，免疫过BP5-BSA的家兔，家兔体内抗 体的含量增加，说明BP5-BSA具有良好的免疫原性。 2. 硫酸铵盐析法测兔抗 BP5-BSA多抗血清中IgG质含量 取硫酸铵盐析法所盐析出的IgG，做50倍稀释，在紫外分 光光度计上，读出OD直计算得： 三、讨论 本次试验通过人工合成 BP5-BSA （血蓝蛋白）作为免疫原， 并制定免疫程序，经过首免、二免及三免后获得兔抗 BP5-BSA多 克隆抗体；通过间接ELISA的方法测定兔抗BP5-BSA多克隆抗体 的效价，间接ELISA实验结果表明，血清中兔抗BP5-BSA多克隆 抗体的量随免疫天数的增加而增多；用硫酸铵盐析对兔抗 BP5-BSA