基因检测相关知识

1、了解基因基因（gene,mendelian factor）是指携带有遗传信息的dna或rna序列（即基因是具有遗传效应的dna或rna片段），也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。基因与健康 基因检测现代医学研究证明，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。像血液分不同血型一样，人体中正常基因也分为不同的基因型，即基因多态型。不同的基因型对环境因素的敏感性不同，敏感基因型在环境因素的作用下可引起疾病。另外，异常基因可以直接引起疾病，这种情况下发生的疾病为遗传病。 可以说，引发疾病的根本原因有三种： （1）基因的

2、后天突变； （2）正常基因与环境之间的相互作用； （3）遗传的基因缺陷。 绝大部分疾病，都可以在基因中发现病因。 基因通过其对蛋白质合成的指导，决定我们吸收食物，从身体中排除毒物和应对感染的效率。 第一类与遗传有关的疾病有四千多种，通过基因由父亲或母亲遗传获得。 第二类疾病是常见病，例如心脏病、糖尿病、多种癌症等，是多种基因和多种环境因素相互作用的结果。 基因是人类遗传信息的化学载体，决定我们与前辈的相似和不相似之处。在基因“工作”正常的时候，我们的身体能够发育正常，功能正常。如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，则可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。 健康的身体依赖身体不断的更

3、新，保证蛋白质数量和质量的正常，这些蛋白质互相配合保证身体各种功能的正常执行。每一种蛋白质都是一种相应的基因的产物。 基因可以发生变化，有些变化不引起蛋白质数量或质量的改变，有些则引起。基因的这种改变叫做基因突变。蛋白质在数量或质量上发生变化，会引起身体功能的不正常以致造成疾病。基因检测概念基因检测是通过血液、其他体液或细胞对dna进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病，也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检测技术做出诊断。

4、 近年来令人非常兴奋的是预测性基因检测的开展。利用基因检测技术在疾病发生前就发现疾病发生的风险，提早预防或采取有效的干预措施。目前已经有20多种疾病可以用基因检测的方法进行预测。 检测的时候，先把受检者的基因从血液或其他细胞中提取出来。然后用可以识别可能存在突变的基因的引物和pcr技术将这部分基因复制很多倍，用有特殊标记物的突变基因探针方法、酶切方法、基因序列检测方法等判断这部分基因是否存在突变或存在敏感基因型。 目前基因检测的方法主要有：荧光定量pcr、基因芯片、液态生物芯片与微流控技术等。传统检测的区别我们通常的医疗检测手段是针对疾病的具体症状或已有病变进行检测。现代科 基因检测服务流程1

5、学的发展促进了医疗检验手段的不断发展，可以深入细微之处对疾病进行纵向或横向的剖析。 大家都知道，人体的基本组成部分是细胞，如果可以对细胞展开一种实质的剖析，就可以找到疾病产生的根源。如癌症是人体细胞发生突变并大量复制的结果。一般医疗检测手段是要看你身体是否已经有癌细胞存在，而对于没有产生癌变的细胞但已经具有的风险却无从得知。基因检测则不然，通过基因检测完全可以准确地告诉你，未来某个生命时段是否存在发生某种疾病的可能性或机率，给你一个预警通知，以便及早采取有效的防病措施。 基因 基因检测 基因测序 体检 gene gene-test 基因检测与常规体检的区别? 疾病易感基因检测与常规体检都能起到

6、预防的作用，但二者反映的是不同的阶段。一种疾病从开始到发病要经历很长的时间。基因检测是人在没发病时，预防将来会发生什么疾病，属于检测的第一阶段;而常规检测是发生疾病后，疾病到达什么程度。如：早期、中期等等，这属于检测的第二个阶段，是临床医学的范畴。所以说，基因检测是主动预防疾病的发生，而传统的体检手段则无法起到这样的预防作用。 传统体检主要针对人体已经出现的临床病变进行诊断和检查，它的主要任务是配合疾病的治疗，无法在病变之前预知，下更多、更深的结论。也就是说，在疾病的预防上，传统体检十分的被动和滞后。现实中很多疾病并无明显征兆，而一旦发病，现代医学往往束手无策，患者及其家人就可能一生痛苦和麻烦

7、。准确率疾病家庭的遗传史就是疾病易感基因的遗传所造成的，所以基因检测能够检测出这些遗传的易感基因型，检测准确率达到99.9999%。检测病种类型(1) d类34种：graves病、桥本甲状炎、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、系统性红斑狼疮、慢性乙肝、慢性重型乙肝、自身免疫性肝炎、乙肝后肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、 i型糖尿病、 vogt-小柳原田综合症 、类风湿性关节炎、尿毒症、 iga系肾病、非iga系膜增值性肾炎、抗肾小球基底膜性肾炎、激素敏感型肾病、肾癌、发作性睡病、哮喘、骨关节结核、克罗恩病、再生障碍性贫血、hiv感染和艾滋病、过敏性鼻炎、牙周炎、膀胱癌、食管癌、结肠癌、直肠癌、

8、白塞氏病、慢性荨麻疹、视神经炎 (2) e类9种：心脑血管疾病易感基因检测(包括原发性高血压、高血脂、冠心病、动脉粥样硬化、出血性脑卒中、缺血性脑卒中、房颤、老年痴呆、高血压合并左室肥厚 ) (3) f类5种：糖尿病及其并发症易感性检测(包括型糖尿病、糖尿病并发肾病、糖尿病眼病、糖尿病心血管并发症、型糖尿病神经病变 ) (4) gc类13种：男性肿瘤易感基因检测(包括肺癌、肝癌、胃癌、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、结肠癌、直肠癌、喉癌、食管癌、胃溃疡、鼻咽癌、膀胱癌、前列腺癌等) (5) hc类15种：女性肿瘤易感基因检测(包括乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌、鼻咽癌、肺癌、原发性肝癌

9、、胃癌、胃溃疡、结肠癌、直肠癌、喉癌、膀胱癌、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等) (6) x类5种：胰腺癌、型糖尿病足、过敏性紫癜性肾炎、老年性白内障、慢性支气管炎。 (7) y类5种：内源性高甘油三酯血症、高胆固醇血症、iib型高脂蛋白血症、高脂血症人群的膳食干预敏感性 (8) 美丽一号m1健康美容基因检测 (9) 美丽二号m2肥胖易感基因检测检测采样方法及流程口腔黏膜采样检测方法很多公司采用口腔粘膜脱落细胞样本采集方式，采集程序如下： 口腔清洁：用清水漱口一到二次。 采前准备：从盒内取出1号管（平底），轻甩一下上下摇动使生理盐水全部沉积在管底。拧开盖子将管立于桌上备用。 刮取细胞：

10、取出口腔粘膜刮勺，伸入口腔将刮勺的头部带齿部分贴在一侧口腔内侧的脸颊部位于上下牙齿之间的部位，稍用力（相当于刷牙的力气）按前后方向在口腔粘膜上刮十余次，再用刮勺头部的另一侧（勿须转动刮勺）刮取另一侧的口腔粘膜，刮取十余次。 收集细胞：将刮勺迅速浸入到1号管的生理盐水中搅动，将粘膜细胞洗到水中。将刮勺提离水面，提留片刻并抖动刮勺使勺上的水全部滴入管中。此时可见生理盐水溶液由清变浊。 固定细胞：取出2号管，轻甩一下使溶液全部沉积在管底。将1号管中的溶液全部倒入2号管中，盖上并拧紧2号管的螺旋盖，上下用力摇10次。 邮寄样品：将2号管置入自封袋的纸袋中，并将自封袋封紧送交检测。 注意： 1、一号管中

11、的溶液为无毒无害的生理盐水。口腔粘膜刮勺不必清洗可以直接再次使用。用户也可用清水洗涤后再使用。 2、二号管内溶液具有腐蚀性，勿将口腔粘膜刮勺浸到2号管（尖底管）中，如此类事件发生，请用清水反复洗涤口腔粘膜刮勺后方可使用。 唾液采样检测方法 便携式唾液采样盒目前出现全新的基因样本采集方法唾液采样检测法，此方法更加方便快捷，并且实现无创采集，检测效果和提取口腔黏膜检测效果一样。下面以成都馨慈公司的唾液采集程序为例体现基因样本采集流程如下： 1、口腔清洁：讲解采样流程及注意事项，要求客户用清水漱口，半小时内不得进食、饮水、吸烟、饮酒或嚼口香糖等。 2、采前准备：戴上一次性医用手套（采用医院标准戴法及

12、程序），打开采集箱准备采样。从包装盒内取出采样管，拔出塞盖后，将采样管插入到采样漏斗中。 4、采取唾液：通过采样漏斗将唾液收集到采样管中，直至采样管上标签所示位置。 注意：要保证实际的唾液量能达到刻度线，上层的泡沫不包括在内，且必须在半小时内完成唾液采样过程。 5、保存样品：从包装盒内取出杯盖，杯盖内含有固定液，将杯盖对准采样漏斗顺时针方向旋紧。确认杯盖旋紧后，颠倒10次，使唾液和固定液充分混匀，保持杯盖在上方，将采样管垂直放置5分钟。保持采样管垂直，拔出采样漏斗，用塞盖盖紧采样管，上下颠倒混匀10次。 注意：杯盖内的固定液应该清亮、无色、透明，如有浑浊请抛弃。请不要用手撕开杯盖内的塑料薄膜。

13、 6、邮寄样品：丢弃采样漏斗与采样杯盖，将采样管与填妥的资料置入自封袋的纸袋中，并将自封袋封紧送交检测。基因亲子鉴定通过遗传标记的检验与分析来判断父母与子女是否亲生关系，称之为亲子试验或亲子鉴定。dna是人体遗传的基本载体，人类的染色体是由dna构成的，每个人体细胞有23对（46条）成对的染色体，其分别来自父亲和母亲。夫妻之间各自提供的23条染色体，在受精后相互配对，构成了23对（46条）孩子的染色体。如此循环往复构成生命的延续。 由于人体约有30亿个核苷酸构成整个染色体系统，而且在生殖细胞形成前的互换和组合是随机的，所以世界上没有任何两个人具有完全相同的30亿个核苷酸的组成序列，这就是人的遗

14、传多态性。尽管遗传多态性的存在，但每一个人的染色体必然也只能来自其父母，这就是dna亲子鉴定的理论基础。 传统的血清方法能检测红细胞血型、白细胞血型、血清型和红细胞酶型等，这些遗传学标志为蛋白质（包括糖蛋白）或多肽，容易失活而导致检材得不到理想的检验结果。此外，这些遗传标志均为基因编码的产物，多态信息含量（pic）有限，不能反映dna编码区的多态性，且这些遗传标志存在生理性、病理性变异（如a型、o型血的人受大肠杆菌感染后，b抗原可能呈阳性。因此，其应用价值有限。 dna检验可弥补血清学方法的不足，故受到了法医物证学工作者的高度关注，近几年来，人类基因组研究的进展日新月异，而分子生物学技术也不断

15、完善，随着基因组研究向各学科的不断渗透，这些学科的进展达到了前所未有的高度。在法医学上，str位点和单核苷酸（snp）位点检测分别是第二代、第三代dna分析技术的核心，是继rflps（限制性片段长度多态性）vntrs（可变数量串联重复序列多态性）研究而发展起来的检测技术。作为最前沿的刑事生物技术，dna分析为法医物证检验提供了科学、可靠和快捷的手段，使物证鉴定从个体排除过渡到了可以作同一认定的水平，dna检验能直接认定犯罪、为凶杀案、强奸杀人案、碎尸案、强奸致孕案等重大疑难案件的侦破提供准确可靠的依据。随着dna技术的发展和应用，dna标志系统的检测将成为破案的重要手段和途径。此方法作为亲子鉴

16、定已经是非常成熟的，也是国际上公认的最好的一种方法。 亲子鉴定的准确性 dna亲子鉴定是目前最准确的亲权鉴定方法，如果小孩的遗传位点和被测试男子的位点（至少1个）不一致，那么该男子便100%被排除血缘关系之外，即他绝对不可能是孩子的父亲。如果孩子与其父母亲的位点都吻合，我们就能得出亲权关系大于9999%的可能性，即证明他们之间的血缘亲子关系。基因体检了解自身是否有家族性疾病的致病基因具有癌症或多基因遗传病（如老年痴呆、高血压等）家族史的人是最需要做基因体检的对象，通过基因体检这些高危险群可以知道自己是不是带有疾病基因，以便及早发现和及早预防，并做好饮食保健与生活习惯的调整，来避免疾病发生的可能

17、。 正确选择药物，避免药物浪费和药物不良反应由于个体遗传基因上的差异，不同的人对外来物质（如药物）会产生的反映也会有所不同，因此部分病人使用正常剂量的药物时，可能会出现药物过敏、红肿发疹的现象，或者是在服用相同药物时，有人觉得神效，有人却不但无效还有毒副作用，基因检测是针对个人的基因做检测，根据每一个人的基因情况，制定特定的治疗方案，从而科学地指导患者使用药物的种类和剂量，进而达到合理用药，避免药物毒副作用，让患者走出用药盲区，用准药，用好药。把握最佳治疗时期。 提供健康风险管理最好的依据目前的很多不良环境因子，如空气、水质及农药的污染加上不良生活习惯像抽烟、饮酒等，都会容易使体内的基因受到破

18、坏而产生疾病。长期暴露在这些高度污染环境或有不良生活习惯的人以及目前身体健康的民众都可以通过基因体检了解个人在不同疾病上的发生倾向，进行全面的生活调整或干预，以期降低风险延缓疾病发生，达到基康所倡导的“个性医疗，解码健康”的目的。基因检测流程苏州健康网2006-10-10 基因检测服务流程1、客户向康和健康服务中心提出检测申请。2、填写基因检测申请单、健康信息记录表。3、按统一标准收取检测费。4、口腔黏膜采样。5、样品送上海复大基因实验室。6、送检后20天左右检测报告书、个性化的健康指导光盘，由复大基因检测中心直接寄达客户。7、康和健康服务中心负责接受咨询和随访指导。8、详情或特殊需要者可直接

19、向本中心咨询。定量pcr编辑本段1.定义广义概念下的定量pcr技术可以分为五种类型： 外参法+终产物分析所谓“外参法”是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。 内参法+终产物分析所谓“内参法”是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。 外标法+过程监测这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。 内参法+过程监测由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所

20、以定量不准。 外标法+过程监测+内对照这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。 在国家没有出台阴阳判定标准时，所用pcr系统灵敏度最好达到一个拷贝（一个病毒）。从理论上说，只要有一个拷贝数，样本就算阳性；一个拷贝数都没有才算阴性。 所谓的实时荧光定量 pcr 就是 通过对 pcr 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 pcr 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 pcr 反应的进行，pcr 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化

21、监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。利用荧光信号的变化实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。real-time pcr技术即实时荧光定量pcr避免了传统pcr以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已经被广泛用于监测细胞mrna表达量的变化；比较不同组织的mrna表达差异；验证基因芯片，sirna干扰的实验结果。 定量pcr是分子诊断的热点技术，它将先进的定量pcr与实时pcr技术相结合，西安天隆生产的国产实时荧光定量pcr仪为肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、同时也为沙门氏菌阪崎氏肠杆菌等食品安全

22、检测提供了先进手段。即使在发达国家，荧光定量pcr仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测范围，以及精确定量、方便快速、无窗口期等优点，美国fda及我国国家标准已将定量pcr仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。 编辑本段2.检测模式pcr过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式： （1）r green i 检测模式。温度循环为945572c三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。 （2）解探针模式（taqman）hydrol

23、ysis probe 。温度循环为9460c二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当taq酶在60c延伸扩增链时，遇到探针，利用taq酶53外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了taq酶53外切酶活性，一般试剂厂家只给taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给

24、taq酶53外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（tm）仅要求其高于60c，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。 （3）杂交探针（hybridization probes）模式。温度循环为945572c三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5碱基上结合第二个荧光染料。在55c时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检

25、测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。 编辑本段3.rt-qpcr组成步骤rt-qpcr是由三个步骤组成: 1.反转录:依赖反转录酶将rna反转录成cdna; 2.扩增:用pcr的方法扩增cdna; 3.检测:实时检测和定量扩增的产物. 编辑本段4.rt-qrcr影响分析可靠性关键点rt-qrcr影响分析可靠性关键点(key porint): 1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计 2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性 3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析

26、，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对rt-qpcr的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。 存在的问题 由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析： 1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品 2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞 3.总rna或者mrna 4.rna反转录成cdna的不同的引发策略 5.不同的酶以及酶的不同组合 6.变异系数、灵敏度 7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。 8

27、.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响rt-qpcr的可信度，重复性。 编辑本段5.rna 质量评价现在rna 定量的程序很多。最近) 比较了用ribogreen, agilent bioanalyser, spectrophotometer,nanodrop and the biorad experion 来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有rna样品的评价。 rna 质量 rna 质量主要包括rna的纯度（没有蛋白质和dna的污

28、染）以及完整性。传统的rna质量的评价通过分析a260/a280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rrna的条带的分析。agilent bioanalyser/biorad experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。agilent的2100也是一种十分好的分析rna质量的方法，它通过分析18s以及28s rrna的分析图谱，通过图谱来反应rna的量和完整性，其完整性通过完整性系数（rin）来反应。样品的rins在10-4之间。10代表完整的rna，4代表没有完整的rrna带。 由于以上的方法并非100%准确定反应mrna的完整性，因为他们只是反应rrna的量来间接测定mrna的完整性

29、。这里推荐一种方法：采用gapdh的3：5分析法。 我们使用oligo dt进行逆转录，然后对逆转录的cdna用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3;5以及中部。扩增产物的之间的比值反应rna的完整性。如果3;5的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。 qrt-pcr抑制物的组成 qrt-pcr抑制物严重减少了pcr的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。 抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及igg. 是否有抑制物的评价体系： 1.通过对

30、目的样品进行梯度稀释进行pcr扩增效率的检测 2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况 3.用细菌检测临床样品的抑制 4.通过标准人工合成的扩增进行rt-pcr来反应目标检测物的抑制情况 反转录反应系统 1.rt和pcr单一酶系统 2.rt和pcr分离的酶系统 3.rna逆转录引物的选择 引物主要有三种： 1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物. 2.oligo-dt：只能用于mrna完整的样品，特别有polya .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3utr的区域比较困难 3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别rna

31、量足够情况下建议使用此法。 编辑本段6.pcr优化pcr优化主要有： 1.引物的浓度 2.建议使用sybr green i和evagreen 进行扩增和溶解曲线的测试 编辑本段7.操作流程 real time pcr操作流程1笔者建议的操作流程: i靶的选择和试验设计 1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断 查看以下三个网站是否有合适的已经证实的qrt-pcr的扩增引物,探针以及反应条件. 如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考: a.最广泛使用的商业化的软件c.如果beacon designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择

32、的服务方案,详细周到 d.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: 您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与ncbi的网站进行比对,并且用ncbi的epcr进行虚拟的电子pcr 引物设计简介 dna引物长度:15-25 个碱基 gc含量:50%左右 如果引物的与at区域富集结合,可以考虑用lna替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的g为负值,即:10 kcal/mol.没有连续的

33、g/c. 引物探针的保存一般遵循以下原则: 正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mm 或者10工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。 2.输入靶序列，用进行比对 3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计 4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低dna的扩增效率以及减少分析的灵敏度。 5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cdna和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组d

34、na的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用dna做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用dnasei处理样品，除去gdna的污染。 6.在rt步骤时，用工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低 7.尽可能用60-150bp的扩增产物，gc含量在60%或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。gc含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是 的扩增时间缩短gdna

35、污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodt进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3区域基因芯片1、简介随着人类基因组（测序）计划（ human genome project ）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而 , 怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。 2、概念基因芯片（又称 dna 芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要

36、求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的dna片段（基因探针），有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片 等支持物上，构成的一个二维dna探针阵列，与计算机的电子芯片十分相似，所以被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。 早在八十年代， bains w. 等人就将短的 dna 片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室

37、走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结 基因芯片合以及激光共聚焦显微技术的引入。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助 基因芯片激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。正如电子管电路向晶体管电路和集成电路发展是所经历的那样，核酸杂交技术的集成化也已经和正在使分子生物学技术发生着一场革命。现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，且已有较为成型的产品和设备问世。主要代表为美国 affymetrix 公司。该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六

38、七年之久，拥有多项专利。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞻目。 基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（southern blotting 和 northern blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。 编辑本段3、原理基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的。基因芯片的测序原理是杂交测

39、序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以 基因芯片的测序原理用图11-5-1来说明。在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列tatgcaatctag，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 基因芯片又称为dna微阵列(dna microarray)，可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cdna片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与

40、目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。2）用点样法固定在玻璃板上的dna探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与dna化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。 它是在基因探针的基础上研制出的，所谓基因探针只是

41、一段人工合成的碱基序列，在探针上连接一些 基因芯片可检测的物质，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。基因芯片通过应用平面微细加工技术和超分子自组装技术，把大量分子检测单元集成在一个微小的固体基片表面，可同时对大量的核酸和蛋白质等生物分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。 由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分类，有杂交型、合

42、成型、连接型、亲和识别型等。由于生物芯片概念是随着人类基因组的发展一起建立起来的，所以至今为止生物信号平行分析最成功的形式是以一种尼龙膜为基质的“cdna阵列”，用于检测生物样品中基因表达谱的改变。 编辑本段4、主要类型目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成（ in situ synthesis ）与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定 基因芯片的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带

43、上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。 原位合成法主要为光引导聚合技术（ light-directed synthesis ），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（ photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。 以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用

44、光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（ mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成 48 （ 65536 ） 个探针的 8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 8=32 步操作， 8 小时就可以完

45、成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到 106/cm2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到 95% 。而通常固相合成反应每步的产率在 99% 以上。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到 98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离

46、缩小而 基因芯片引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导 ，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到 1010/cm2 。 除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国 incyte pharmaceuticals 等使用压电打印法 (piezoelectric printing) 进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为 4

47、0 到 50 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到 99% 以上。 尽管如此，通常原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的 affymetrix 等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。 后一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的 dna 或多肽固相合成仪以完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国 biodot 公司的点膜产品以及 cartesian technologies

48、公司的 pixsys nq/pa 系列产品。前者产生的点阵密度可以达到 400/cm2 ，后者则可达到 2500/cm2 。 编辑本段5、相关技术样品的准备及杂交检测目前，由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，不过也有不少人试图绕过这一问题，如 mosaic technologies 公司引入的固相 pcr 方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； lynx therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 dna 片段进行克

49、隆，且无需单独处理和分离每个克隆。 显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏度仍较低。目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的 5-35 倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础 8 。但荧光法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。 对于以核酸杂交为

50、原理的检测技术，荧光检测法的主要过程为：首先用荧光素标记扩增（也可以有其 基因芯片它放大技术）过的靶序列或样品，然后与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步 9 ）这时，用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较。前已述及，由于正常的 watson-crick 配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子在不位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每

51、种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。 基本步骤生物芯片是将生命科学研究中所涉及的不连续的分析过程(如样品制备、化学反应和分析检测)，利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。 生物芯片技术主要包括四个基本要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。1、芯片制备，先将玻璃片或硅片进行表面处理，然后使dna片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上。2、样品制备，生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应。可将样品进行生物处理，获取其中的蛋白质或dna、rna，并且加以标记

52、，以提高检测的灵敏度。3、生物分子反应，芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配比率。4、芯片信号检测，常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过扫描以获得有关生物信息。 1、芯片制备 目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cdna作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 2、样品制备 生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品

53、的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或dna、rna，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 4、信号检测和结果分析 杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（micro total analytical sy

54、stem）或称缩微芯片实验室（laboratory on a chip）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。 编辑本段6、基因芯片的应用1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥

55、（ arabidopsis thaliana ）、酵母 (saccharomyces cerevisiae)及人的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共 157,112 个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异 。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，例如对人 brca 基因外显子 11、 cftr 基因 、 - 地中海贫血 、酵母突变菌株间 、 hiv-1 逆转录酶及蛋白酶基因（与 sanger 测序结果一致性达到 98% ） 等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型 ，人线粒体 16.6kb 基因组多态性的研究 24 等

56、。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因（ ras 等）的单碱基突变 。此外，有人还曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法，但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的问世无疑为杂交测序提供了实施的可能性，这已为实践所证实。 在实际应用方面，生物芯片技术可广泛应用于疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。 药物筛选和新药开发由于所有药物（或兽药）都是直接或间接地通过修饰、改变人类（或相关动物）基因的表达及表达产物的功能而生效，而芯片技术具有高通量、大规模、平行性地分析基因表达或蛋白质状况（蛋白质芯片）的能力，在药物筛选方面具有巨大的优势。用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验甚至临床，缩短药物筛选所用时间，提高效率，降低风险。 随着人类基因图谱的绘就，基因工程