第六章热原的去除及验证

1、热原的去除及验证 热原(Pyrogens)是微生的代谢产物。大多数细菌都能产生，致热能力最强的是革兰 氏阴性杆菌所产生的热原。霉菌甚至病毒也能产生热原。含有热原的输液注入人体，大约 半小时以后，就使人体发冷、寒战、体温升高、身痛、出汗、恶心呕吐等不良反应，有时 体温可升至40C,严重者出现昏迷、 虚脱，甚至有生命危险。 热原反应的温度变化曲线，因热原种类不同而有差异。一般先经过一个短的潜伏 期后，温度略微上升，然后又略微下降，接着又很快上升，并出现一个高峰，根据这种 现象而导致一个假设: 即细 性热原本身不引起发热反应。 但热原使多型核白细胞 (polymorphonucler leucocy

2、te)及其 他细胞释 放一种内 源性热原 (endogenous pyrogen),虽然有 人提出内源性热原 可能是蛋白质或脂 蛋白(lipoprotein)组成， 但其确切组成尚未肯完，它作用于视丘下部体温调节中枢，可 能引起5-轻色胺的升高 而导致发热C1,热原的致热量因 种而异，由于注射途径不同，引起发热反应的程度也 有差异。 1.热原的组成 热原是微生物的一种内毒素，它存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是由磷脂、 脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖(I ipopolysacchar ide)是内毒素的主要 成分，具有特别强的热原活性，因而大致可以认为内毒素二热 原二脂多糖。脂

3、多糖的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分出来的脂多糖中有 68%69%的糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、氨基葡萄糖、鼠李糖等),12- 13%的类脂 化合物，7%的有机磷和其它一些成分。热原的分子量一般为10 IO左右。 热原的结构 (2)超滤法 超滤的原理通常认为是分子筛，其有效性与筛的大小有关。LPS的分子量约为 10,000 -20, 000道尔顿，因此可以被10,000道尔顿的超滤膜除去。实际上热原聚合物 的分了量约100, 000道尔顿，所以0.1 um的滤膜通常能有效的除去热原。 (3) 活性炭吸附法 古老的方法之一，很早就有文献记载。活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤 脱色作用

4、，所以在注射剂中使用较广。常用量为0.1%0.5%。此外还可 用活性炭与白陶土合用除去热原。活性炭适用的pH范围较宽，不受电解质浓度 影响。这 种方法在制剂应用较广，如生理盐水，葡萄糖和抗生素等的除热原。缺 点是对某些活性成 份有吸附。 (4) 疏水吸附法很多的脂肪族聚合物对热原有吸附性，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二乙烯，聚 四氟乙烯。这些聚合物的非极性基团使滤膜有疏水性。膜和脂多糖A之间的疏水吸附是 溶液中的热原被吸附的原因。 (5) 静电修饰过滤 这种滤膜利用两种作用方式：pH 2. 0时原热带负电其行为像阴离子，因此 滤膜中 使用阳离子吸附热原。也利用滤膜中纤维分支与热原的碰撞、沉积、筛分来捕

5、获热原。 这些滤膜通常较厚，也有一些仅带正电的滤膜。 (6) 吸附色谱法 这是一个应有较广的方法，吸附剂包括Polymixin B , Substrate Ana I ogueSepharose, LAL Sepharose, DEAE Sepharoseo Sepharose 色谱柱可以 在很 长的时间内保留吸附能力。并能用1% sodium deoxycholate再生。 (7) 粘合剂提取法 有很多化学物的特性可用以实验，优其是热原的检查，最近Profos AG使用相技术 提取热原。但大多数的这些粘合系统不适合于大规模的应用而只能用于实 验。 (8) 用反渗透法通过三醋酸纤维膜除去热原这

6、是近几年发展起来有实用价值的新方 法。反渗透膜是很薄的纤维或聚酰胺膜，通过分子筛的形式阻碍原热聚合物通过滤膜， 因为这样某些产品的使用有所 限制。良好的反渗透膜可以去除99.5% - 99.9%的热原， 即使负荷达10,000 EU/mI o常见的问题是膜穿孔。 (9) 漂洗法 严格来说漂洗不是除热原的方法，但是在很多情况下能成功的除去小量的热原。注 射用水清洗系统经常用于处理大容器，管道。热和超声可以提高效率。由于其内在的变化 性，漂洗程序要仔细的验证。 钝化法 (10) 离子交换法 国内有用#301弱碱性阴离子交换树脂10%与22弱酸性阳离子交换树脂8%成功地除 去丙种胎盘球蛋白注射液中的

7、热原； (11) 凝胶滤过去 国内有用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶(分子筛)制备无热原去离子水；钝化包括热、 湿和干，化学钝化和部分破坏，氧化(H202)。 (12) 干热除热原 对于注射用的针筒或其他玻璃器皿，在洗涤干燥后，于250C加热30分钟以上，可 以破坏热原；需要验证说明热原的3个对数下降。要求进行热原挑战性试验，例如用热原 挑战瓶子和ECVs来建立干热除热原过程导致的热原的对数下降。 (13) 酸碱化学钝化 玻璃容器、用具还可用重锯酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，可将热原破 坏；酸水解 作用于酸不稳定的ketosidic链，使LipicHA从热原分子中分离。KD0和核心 polysacc

8、harides是整个分子中脂部分的绝以载体。一旦出现分离，脂多糖A不溶于 水，热原活性下降或消失。碱水解靠脂肪酸的皂化，使热原分子发生化学和生化变化。 一般来说碱水解的效力低于酸水解，0. 25N NaOH , 56oC, 1 hour仅能中度破坏热原。加入95%乙醇或80% dimethyl sulfoxide可以提高 效果， 但工艺难于处理不能广泛应用。 (14)过氧化氢 失去致 早在1912 Hort & Penfo I d证实用双氧水清洗后Sa Imone I I a Typhosa细 热能力。双氧水对热原的作用机理未明。可能是脂多糖A过氧化所致。热可以增加过氧化 氢的作用。本法优于酸

9、碱法，但可能使产品变质。 (四)原水处理原水处理方法有离子交换法与电渗析法及反渗透法，离子交换法制得的离 子交换水主要供蒸f留法制备注射用水使用，也可用于洗瓶，但不得用来配制注射液，因 其在除热原方面还不如蒸憎法那样可靠，有时还带有乳光。电渗析法与反渗透法广泛用 于原水预处理，供离子交换法使用，以减轻离子交换树脂的负担。 前面已提到，热原是微生物污染产生的致热物质，是病人注射后发热反应的根 源。这 些致热物质是 菌外壁的脂多糖或内毒素。由于它的耐热性，灭菌后或过 滤后仍可以水中 存在。 再多次蒸f留，在无 注射用水应采用合适的方法式去除热原。由于热原是有机物，可以将它们氧 化为易从 水中去除的

10、气体或非挥发固体。高猛酸钾是常用的氧化剂，小量氢氧化顿可以增加其效 率，氢氧化钦可以碱化溶液，使酸生成非挥发性领盐。这两种试剂加入多次蒸f留的水中， 条件下收。如果很好的生产，用这 种方法可以得到高纯，无菌，无热 原的水。不管采用哪种方法均要进行热原检查以保证无热原。 除热原工艺举例：烘箱、管道灭菌器、洗瓶、胶塞清洗，例如用氢氧化钠清洗，过 滤O 5.验证：工艺过程中只要存在除热原步骤，不论采用何种除热原的方法均应进行验证。 验证的目标是获得热原的3个对数单位下降。 对数下降的计算: 对数下降二未处理样品热原的对数值-处理后样品热原对数值以干热除热原为例： 未处理的样品的热原值二3,200 E

11、U/ml处理后样品的热原值二0. 7 EU/ml对数下降二 Log (3,200) - Log (0. 7)= 3.505 一 (-0. 155) =3.7 热原挑战试验 大多数情况下热原挑战试验是验证的必须部分。这需要丞载一定浓度的热原的载 体。载体必须能代表工艺要处理的实际的产品。 所用的瓶子：制备 50, 000 EU/ml浓度的热原溶液。每瓶加入100 I热原溶 液, 空气干燥或冻干。烘试验瓶子，保留未烘的瓶子作对照用。用1ml LAL水溶 液复溶，彻底 涡旋，将对照样品稀释至1/10,000 ,测定每个瓶子。 用动力学方法所得的结果如下: 考虑点： 采用干热除热原时要研究工艺的冷点。这些信息可以用以样正瓶了在烘箱或管道灭 器中的位置。 技术人员要知道可以热处理的物品与只能清洗的产品的明显区别。热处理与时间和 温度有关。清洗与工艺较为复杂，因为热原粘附于表面，如橡胶，多孔性聚合物。常见的 问题是没有合适的方法来证明小量热原的复