泛素特异性蛋白酶USP2b通过靶向TBK1负向调控IFN β的产生和抗病毒反应

1、泛素特异性蛋白酶 USP2b通过靶向TBK1负向调控IFN- p的产生和抗病毒反应天然免疫系统通过模式识别受体 , 包括 Toll 样受体 (TLRs) 、RIG-I 样受体(RLRs)和DNA受体等,识别入侵机体的病原微生物模式相关分子(pathogen-associated molecular pattern, PAMP),经过一系列信号转导 , 进而启动天然免疫反应。识别PAMP后,这些受体进而活化共同的下游通路激活转录因子包括转录因子 NF- K B 和 IRFs (interferon regulatory factors),进而产生炎性细胞因子以及 I 型干扰素,进而诱导随后的适应

2、性免疫应答。I 型干扰素与其受体相互作用 , 活化 JAK (Janus kinase) 和 STAT (Signaltransducers and activators of transcription)信号通路 , 诱导IFN-stimulated genes (ISGs)的表达,这些ISGs协同作用,激活机体的抗病毒反应。尽管,I型干扰素在机体的清除病毒反应中起着非常重要的作用，但是异常的I 型干扰素的产生 , 会引发各种相关免疫疾病。因此,严格的调控 I 型干扰素对于维持机体的免疫稳态是非常重要的。去泛素化酶(DUBs)能够从靶蛋白上切除泛素分子或者泛素样分子。已有研究表明,一些DUB

3、s参与调控I型干扰素通路。类如A20 DUBA泛素特异性蛋白酶17(USP17)、USP4以及USP3等分子通过不同的作用机制调控I型干扰素通路。USP2属于泛素特异性蛋白酶家族,由于剪接方式不同,产生3个剪接体USP2aUSP2t和USP2G有研究表明USP22通过靶向TRAF6负向调控IL-1 p和病毒诱导的NF- K B活化,然而USP2在I型干扰素通路以及机体抗病毒反应中的作用仍然未知。因此，本研究从以下几个方面进行。研究目的：1.USP2是否参与调控I型干 扰素通路 , 那个剪接体会发挥作用。2. 探讨USP2调控I型干扰素通路的作用机制。3.USP2是否参与调控其他的 天然免疫信号

4、通路。研究方法：1.病毒SeV诱导的I型干扰素通路中,USP2表达情况SeV感染HEK293或THP1细胞不同时间点Western blot 检测USP2蛋白表达。2.USP2调 控病毒诱导的I型干扰素IFN- P的表达2.1报告基因方法检测USP2对IFN- p报 告基因活化的影响HEK293细胞转染不同梯度USP2aUSP2b和USP2c表达质粒以 及IFN- p -luc报告基因质粒20h后,SeV刺激8h,报告基因检测IFN- p -luc的活 化。HEK293细胞转染USP2干扰RNA以及IFN- p -luc报告基因质粒48h后,SeV 刺激8h,报告基因检测IFN- p -luc

5、的活化。2.2PCR扩增检测USP2对IFN- p基 因表达的调控HEK293细胞转染USP2a USP2b和USP2c表达质粒20h后,SeV刺 激8h,PCR检测IFN- p基因表达。HEK293或 THP1 细胞转染 USP2干扰 RNA48h后,SeV 刺激 8h,PCR检测 IFN- p 基因表达。3.USP2调控I型干扰素通路的作用机制3.1确定USP2作用的靶分子 将RLRs信号通路中的接头分子 RIG-I, MDA5,MAVS,TBK1和IRF3-5D以及USP2b 质粒共转染到HEK293细胞中,24h后,PCR检测IFN- p基因表达。HEK293细胞转染接头分子 RIG-

6、I, MDA5,MAVS,TBK1 和 IRF3-5D 以及 USP2b 质粒和IFN- p -luc报告基因质粒24h后,报告基因检测IFN- p -luc的活化。3.2USP2b与靶分子TBK1(TANK-binding kinase1)的相互作用HEK293细胞转染Flag-USP2b以及HA-TBK1使用Flag标签抗体做免疫共沉淀（IP）,使用标签抗体HA,检测USP2b与 TBK1之间的相互作用。THP1细胞用SeV刺激不同时间点,使用USP2抗体做IP, Western blot 检测 内源USP2b与TBK1的相互作用。3.3USP2b对TBK1的 K63位点泛素化影响HEK2

7、93 细胞转染Flag-USP2b或者USP2干扰RNA以及Myc-TBK1 HA-Ub,使用Myc标签抗体做IP, Western blot检测TBK1的泛素化水平。HEK29细胞转染 Flag-USP2b和 Myc-TBK1 以及 HA-Ub(K48)或者 HA-Ub(K63), 使用Myc标签抗体做IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。HEK293细胞转 染 Myc-TBK1, HA-Ub和 Flag-USP2b 或者 USP2bC67A使用 Myc标签抗体做 IP,Western blot检测TBK1的泛素化水平。3.4USP2b对TBK1激酶活性的影响HEK293细

8、胞转染Flag-USP2b表达质粒或 者USP2干扰RNA,SeV刺激6h,使用TBK1抗体做IP,检测TBK1激酶活性。4. USP2b 的抗病毒作用HEK293细胞转染Contrl质粒、USP2I:或者USP2b C67A,24h后进步转染poly(I:C)或者PBS,8h后,VSV感染24后，收集培养细胞的上清(含VSV), 剩余细胞提取RNA上清做空斑试验，检测病毒滴度；RNA反转录成cDNA, real-time PCR 检测细胞内 VSV RNAS制。HEK29或THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA方法同上，分别检测病毒滴 度以及VSV RN复制。5. USP2b在其他天然免

9、疫信号通路中的作用 HEK293细胞 转染USP2b质粒或者干扰 RNA同时转染TRIF, cGAS加STING和IFN- p -luc报 告基因质粒，报告基因检测IFN- p -luc的活化。THP1细胞转染对照或者USP2干扰RNA48h分别用LPS poly(I:C)刺激或者 转染ISD12h, PCF检测IFN- p基因表达。研究结果：1.SeV感染HEK293或 THP1 细胞后,USP2表达下调2. USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素IFN- p的表达。2.1过表达USP2I抑希y SeV诱导的IFN- p -luc的活性2.2过表达USP2t抑 制SeV诱导的IFN- p基因

10、的表达2.3过表达USP2I抑制SeV诱导的IRF3-luc的 活性2.4USP2b的点突变C67A不能抑制SeV诱导的IFN- p -luc以及IFN- p基因 表达。3.干扰掉USP2bf,增强IFN- p的表达3.1USP2b的特异性siRNA可以干 扰掉USP2b的表达（mRNA和蛋白水平）。3.2干扰掉USP2b后,SeV诱导的IFN- p -luc活性以及IFN- p基因都增加。4. USP2b靶向TBK1USP2抑制RLRs信号通路中的接头分子 RIG-I, MDA5,MAVS,TBK活化的 IFN- p -luc 和 IFN- p 基因，而对 IRF3-5D 活化的 IFN-

11、p -luc 和 IFN-p 基因表达没有影响。5. USP2b能够对TBK1的 K63位去泛素化5.1USP2b与TBK1相互作用。5.2 过表达USP2b降低TBK1泛素化水平,USP2b的点突变C67A则不能降低BK1泛素 化。相反,干扰掉USP2b后,TBK1的泛素化水平增加。作为对照,USP2b对RIG-I 和MAVS勺泛素化水平没有影响。5.3过表达USP21:能够减少TBKl的K63位泛素化水平。6. USP2I消弱TBK1 激酶活性过表达USP2b消弱SeV诱导的TBK1激酶活性,相反,干扰掉USP2I后,SeV 诱导的TBK1激酶活性增加。7. USP2b负调细胞的抗病毒反应

12、过表达 USP2bf ,VSV病毒滴度以及VSV的RNA复制增加,相反,干扰掉USP2b后,VSV病毒滴度以及VSV的 RNA受到抑制。8.USP2b负调TLR3/4和DNA诱导的I型干扰素信号通路过表达 USP2bW制TRIF（TLR3通路）以及cGAS加 STING （DN A通路）诱导的IFN-p-luc活性,相反, 干扰掉USP2b后,IFN- p -luc活性增加。THP1细胞中，干扰掉USP2I后,LPS （TLR4配体）、poly（l:C）（TLR3 配体）以 及ISD （DNA受体活化剂）刺激的IFN- P基因表达增加。结论：I.SeV刺激后,USP2b 表达下调,USP2b负向调控病毒诱导的I型干扰素通路。2. USP2b靶向TBK1,通过与TBK1相互作用,对TBK1进行K63位去泛素化。3. USP2b 负向调控细胞的抗病毒反应。4. USP2b负调TLR3/4和DNA诱导其他天然免疫信号通路。创新点和意义: 1.本研究首次证明USP2b可以负向调控IFN- P的产生及细胞的抗病毒反应。研究发现USP2b负向调控I