中医论文开题报告

1、湖北中医药大学2013级硕士生开题报告百合知母汤抗抑郁细胞内信号转导通路的机制研究研 究 生 姓 名：*导师姓名、职称：* 教授学 科 专 业：基础医学院 研 究 方 向：方剂的配伍规律及临床运用 2015年4月17目录一、研究目的与意义31、研究目的32、研究意义3二、研究现状31、百合病的研究现状32、抑郁症的研究现状43、百合知母汤的研究现状6三、研究思路与立题依据61、研究思路62、立题依据7四、研究内容及目标 7五、拟解决的关键问题7六、研究方案81、实验动物82、药物制备83、CUMS抑郁症模型大鼠制备 84、行为学指标的测量95、尼氏染色106、生化指标的检测10七、技术路线图1

2、2八、可行性分析12九、课题创新性13十、预期结果13十一、课题经费预算13参考文献14一 研究目的与意义1.研究目的 百合病最早见于张仲景的金匮要略，属中医情志病范畴。金匮百合狐惑阴属阳毒病证治篇将“百合病”描述为：“意欲食复不能食，常默然，欲卧不能卧，欲行不行，饮食或有美时，或有不用闻食臭时，如寒无寒，如热无热，口苦，小便赤，诸药不能治，得药则剧吐利，如有神灵者，身形如和，其脉微数。”从百合病的临床表现看，与抑郁症的诊断标准有较多的相似之处。所以现代不少医家都将中医的百合病归属于抑郁症1,2,3。百合知母汤为治疗百合病的经典方药之一，由百合和知母两味药组成。百合宁心安神，润肺止咳；知母清热

3、泻火，滋阴润燥。百合甘寒清润而不腻，知母苦寒降火而不燥。百合偏于补，知母偏于泻。二药伍用，一润一清，一补一泻，共奏润肺清热，宁心安神之效。主治阴虚或温热病后余热末清，以致头昏、心烦不安、失眠等症以及情志不遂，以致精神恍惚、不能自制等症。 故本课题旨在通过体动物实验揭示百合知母汤抗抑郁可能的细胞内信号转导机制。2.研究意义 抑郁症是常见的危害人类身心健康一类精神疾病，以显著而持久的情感或心境低落为主要特征，在WHO的一项流行病学调査中发现全世界约有10%-20%的人一生中曾有过抑郁体验4。随着现代社会的生活压力逐渐增高、工作节奏加快，人们处于应激状态中的机会增多，抑郁症的发病率更逐年上升5,6，

4、越来越多的患者正遭受抑郁症的折磨，给家庭及社会造成了严重的经济负担。因此，加强抑郁症的防治，寻找安全、有效的治疗方法，具有非常重要的社会和经济意义。 抑郁症发病机制复杂，诱因繁多，针对某一单一环节的药物难以取得满意的疗效，许多抗抑郁西药存在抗抑郁谱窄、起效慢、药价高、依从性差、副作用大及易复发等不足7。传统的中医学中蕴含着丰富的心身医学思想，其“形神合一论”，“天人合一论”就包含了广义的心身医学思想。因此国内外越来越重视传统中草药及复方抗抑郁的研究，开展了广泛而深入的实验研究，积累了丰富的经验，且实验研究成果在临床运用中也取得了良好的疗效，为中医学和现代心身医学的融合、发展提供了新的契机。中医

5、心身医学研究工作逐渐起步，心身医学的中医药防治研究工作在病因病机及临床诊断方面也取得一定的进展8。随着分子生物学的发展，抗抑郁药物抗抑郁作用机制已由细胞外单胺递质途径，逐步转向细胞内信号转导机制，而目前针对百合知母汤抗抑郁作用机制的研究大都局限在行为学观测、脑内神经递质和神经内分泌等方面。本研究采用大鼠慢性应激结合孤养抑郁模型，对百合知母汤的抗抑郁作用及其细胞内作用机制进行研究，以期为其进一步的新药开发研究和临床应用提供实验基础。二 研究现状1.百合病的研究现状1.1百合病的起源百合病始见于张仲景金匮要略百合狐惑阴阳毒病证治第三篇：百合病者，百脉一宗，悉致其病也。意欲食复不能食，常默然，欲卧不

6、能卧，欲行不能行，饮食或有美时，或有不用闻食臭时，如寒无寒，如热无热，口苦，小便赤，诸药不能治，得药则剧吐利，如有神灵者，身形如和，其脉微数。这段文字概括了百合病的主要症状是精神、饮食、睡眠、行为、语言、感觉的失调，与西医学抑郁症的主要症状有颇多相似之处。“百脉一宗者，分之则为百脉，合之则为一宗”因人体百脉同出一源，源病则百脉合病，周身受累，因此而得名百合病。1.2百合病的病因病机百合病的病因病机为伤寒热病之后，余热伤阴，或情志不遂，郁热伤阴，导致心肺阴虚内热，百脉失养而成。病机特点是心肺阴虚内热，心神失养，以神志改变为主要临床特点。心肺阴虚，余邪未尽，则出现口苦、小便赤、脉微数。该组症状是百

7、合病的主要客观体征。百脉遍布周身，百脉失和，则行动感觉变异，如“欲卧不能卧，欲行不能行”“意欲食复不能食，饮食或有美时，或有不用闻食嗅时”“如寒无寒，如热无热”等。神志失和，则现“如有神灵者”“常默默”。1.3百合病的治疗法则百合病以心肺阴虚为基本病机，以滋养心肺、润燥安神为治疗法则。可“随证治之”分为以下几型：正治法：“百合病，不经吐、下、发汗，病形如初者，百合地黄汤主之。”百合病未经误治，日虽久而病形如初者，以滋养心肺阴血，清热安神为法，以百合地黄汤主之。取百合润养心肺，清气分虚热，生地滋养心血，清血分虚热，泉水煎药，取清热助阴，血热从小便下行之功。诸药合用，心肺得养，气血同治，阴复热清，

8、百脉和调，病症自除。误汗后：“百合病发汗后者，百合知母汤主之。” 百合病误用汗法，汗后阴液受伤，心肺阴虚加重，燥热尤甚，除具备百合病的基本症状外，尚可出现津伤燥热的心烦、少寐、口干或渴、午后潮热、小便短少等症候。治宜养阴清热、润澡除烦，用百合知母汤主治。误下后的滑石代赭汤(百合、滑石、代赭石)。误吐后的百合鸡子汤(百合、鸡子黄)。久病变渴的外用百合洗方(百合)。如内服外洗仍口渴不解，方用栝蒌牡蛎散(栝蒌根、牡蛎)。久病变发热的百合滑石散(百合、滑石)。2.抑郁症的研究现状2.1抑郁症的起源 抑郁症是一种情感性精神障碍，临床上以情绪低落、思维迟缓和精神运动性抑制为特征，其它症状包括丧失自尊、不恰

9、当的内疚感、死亡和自杀念头、注意力集中程度降低以及睡眠和食欲减退，还可能伴有各种躯体症状。 抑郁症是一种最普通的精神疾病。我国对情感性精神障碍进行流行病学调查1985年：终生患病率约为12%。我国对抑郁症的识别率低,临床漏诊率达50-60%。一般内科医生对包括抑郁症在内的心理障碍的识别率只有15.9%,约只有1/4的抑郁症病人才能接受正规治疗。有专家认为我国抑郁症的发病率应为10-15%，随着人口的逐步老龄化，抑郁症在60岁以上人群中的发病率将高达 20%50%。1994年WHO全球调查发现,抑郁症的现症患病率现症患病率为11.4%,终生患病率为20-30%。约13 - 20%的人一生中曾有过

10、至少一次抑郁体验。2001 年世界卫生报告指出，抑郁症目前已成为世界第四大疾患，到 2020 年抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病，抑郁症正在成为一个严重的全球问题9-13。2.2抑郁症的发病抑郁症的病因十分复杂，一般认为病因可能与遗传、人格特征、心因因素有关。其发病机制也处于假说阶段，主要包括单胺递质学说、神经内分泌学说、信号通路学说14-15。单胺假说作为抑郁症研究的重点认为单胺类神经递质(如5-轻色胺、多巴胺、去甲肾上腺素等)的失衡可导致抑郁的发生。大量研究亦显示抑郁症与遗传、神经、心理等因素诱发的中枢5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺(Norepinephrine,NE)、多巴胺(

11、Dopamine, DA)等单胺类神经递质含量降低及其受体功能下降有关16-17。有研究18表明抑郁模型大鼠下丘脑、纹状体、海马内5-HT、NE及DA及其代谢产物、合成前体的含量明显降低。这也支持了经典的单胺递质学说。5-HT：抑郁症的发病机制涉及突触间隙5-HT水平及5-HT受体亚型功能的失调。5-HT功能活动降低,则患者心情抑郁、食欲减退、运动活动减少。Coppent19等于1965年首先提出5-HT与抑郁症有关,认为抑郁症是由中枢神经系统5-HT释放减少,突触间隙的含量下降而引起的。近年来,研究发现了很多5-经色胺的受体亚型,使得5-HT递质系统与抑都症发病的关系越来越受到关注。NE：大

12、量研究证明脑内N E的绝对或相对缺乏会引起情绪低落、心境抑郁。Schildkraut20于1965年首先提出抑郁症的发生是由于脑中NE不足所致,中枢神经系统中NE含量不足则发生抑郁症NE的缺乏可能是由于内源性的生成释放异常或由于NE系统慢性刺激所致的继发性粍竭21。Bmnello22等指出,自从发现一些药物通过改变NE代谢既能导致抑郁症又能缓解抑郁症,NE在抑郁症中所起的作用越来越受到关注。DA：1975年Randrup首先提出,抑郁症的发病可能与DA有关。后来Maj等研究者证实,几乎所有长期抗抑郁治疗的患者都会增加D A诱导的奖赏反应。1983年Willner等提出抑郁症存在DA功能的降低,

13、尤其是伴随有精神运动迟滞的患者23。对抑郁症自杀者尸检结果提示,抑郁症自杀患者尾状核和伏核的DA代谢率降低24。 目前,抑郁症的神经内分泌机制研究中,下丘脑一垂体一肾上腺轴(HPA轴)功能亢进是较为公认的发病机制之一。大量研究显示,抑郁症患者的HPA轴功能亢进,血浆促肾上腺皮质激素释放激素CHR、促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(CORT)浓度明显升高,而且这种功能亢进是依赖性的,随着抑郁的恢复,HPA轴的功能也逐步恢复正常25。Catalan26等发现抑郁症患者下丘脑及下丘脑外的促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)浓度都升高,重度抑郁组比轻度与中度抑郁发作CRF血浓度更高,且CRF与皮质醇

14、血浓度显著相关。在发病机制方面，受体后信号通路及其第二信使系统在该病发病及治疗中的作用是当前研究的热点。以脑内cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein ,CREB ）为交汇点的细胞内信号转导通路正受到越来越多的关注，尤其是海马CREB的改变。早在1996 年，Nibuya27等就报道抗抑郁治疗，大鼠海马 CA1 区、CA3 区和齿状回均可见CREB mRNA的表达增多。CREB 可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点。海马CREB的表达和活化受到多种信号分子和信号通路的影响：腺苷酸环化酶/环磷酸腺苷/蛋白激酶A通路(AC/cAMP/PK

15、A通路)，是研究最早的抗抑郁通路。其主要过程是：胞外信号激活胞膜上G蛋白耦联受体AC激活胞内cAMP升高(降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶)PKA激活CREB磷酸化调节基因转录生物学效应。Li和Branski28,29等实验研究发现海马cAMP通路的激活对改善抑郁症状起积极作用。酪氨酸激酶受体B/丝裂原活化蛋白激酶/核糖体 S6激酶通路(TrKB/MAPK/RSK通路)，是一条和细胞生长、增殖、凋亡以及突触可塑性密切相关的信号通路。在各种 MAPK 通路中，细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)信号通路与抑郁症关系最为密切。ERK1/2 通路激活的大致过程是：TrKB 的激活MAPK激酶激

16、酶(MAPKKK, RAF)的激活MAPK激酶(MAPKK, MEK)的激活ERK1/2的激活RSK的激活 CREB 磷酸化调节基因转录生物学效应。抑郁症患者的尸检报告显示脑内MAPK减少可能是严重抑郁症的病因之一30。Ca2+/钙调蛋白/钙调蛋白依赖的蛋白激酶通路(Ca2+/CaM/CaMK通路)，通路涉及多种离子通道、受体和酶，其激活的主要过程是：胞浆内钙浓度升高钙离子与CaM结合激活CaMKCREB磷酸化调节基因转录生物效应。王庆松等31利用猫对大鼠造成急性捕食应激，发现在捕食应激后大鼠海马细胞内CaM 信号通路调控紊乱，表现在细胞内 Ca2+浓度明显升高，Ca2+-CaM 复合体增多，

17、CaMK的表达升高，提示海马该信号转导通路在严重心理应激所致的行为异常中可能有重要意义。3.百合知母汤的研究现状3.1百合的研究现状方中百合为百合科植物百合Lilium brownii F. E. Brown var. colchesteri Wils.、卷丹 Lilium lancifolium Thunb.和细叶百合 Lilium pumilum DC.的肉质鳞茎。味甘，性微寒。入心、肺经。本品气味稍缓，甘中有收，既能清心肺之余热，而敛气养心、安神定魄，用于治疗热性病后、余热末尽所引起的神思恍惚、烦躁失眠、莫名所苦的“百合病”，又能润肺止咳，用于治疗肺燥咳嗽，或肺虚久咳，或阴虚久咳、痰中带

18、血等症。百合中主要含有酚酸甘油酯、苷类、生物碱及多糖，另外还含有一些磷脂、蛋白质和无机元素。药理研究表明百合具有抗癌、止咳、耐缺氧与抗疲劳、提高机体细胞免疫功能等作用32-34。 3.2知母的研究现状方中知母为百合科植物知母 Anemarrhena asphodeloides Bge.的根茎。味苦、甘，性寒。入肺、胃、肾经。本品质润，苦寒不燥、，沉中有浮，降中有升。上行能清肃肺气，以泻肺火，润肺燥、除烦热、止咳嗽，用于治疗温热病，邪在气分，症见高热、烦躁、口渴、脉洪大者，以及阴虚燥咳，或肺热咳嗽诸症；入于中，善清胃火、除烦渴，用于治疗消渴病之中消诸症；行于下，则能泻相火、滋肾燥，用于治疗阴虚火

19、旺、骨蒸潮热、盗汗等症。 知母主要含有皂苷、黄酮、双苯吡酮、木脂素等成分。现代研究表明，知母具有抗病原微生物、抗血小板聚集、降血糖、解热、抗炎、降低转氨酶等多种药理活性35-37。3.3 百合知母汤的研究现状 百合知母汤有养阴清热、除烦润燥之效，以润养心肺为大法，治疗百合病误汗后，津液受伤，虚热较甚者。临床上运用百合知母汤治疗乳腺增生病38-39、长期低热40、消渴、喘证、盗汗、胃脘痛41、失眠42、抑郁43等症。三 研究思路与立题依据1.研究思路百合知母汤是金匮要略中治疗百合病的经典方剂。百合病的描述“百合病者，百脉一宗，悉致其病也，欲卧不能卧，欲行不能行意欲食复不能食，常默默，如有神灵者”

20、主要归纳为情绪障碍、躯体不适，与现代医学抑郁症的诊断标准有很大的相似性，因此一般将百合病归属于抑郁症范畴。百合知母汤中的部分有效成分能通过提高抑郁症大鼠大脑皮层单胺递质、抑制HPA轴亢进、提高模型动物脑组织BDNF含量等途径发挥抗抑郁效应。CREB 可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点。抗抑郁药物(包括中药)或其它治疗措施可通过调节一种或几种通路，最终激活CREB，调节 BDNF 等基因表达，影响神经元增殖、分化、成熟等可塑性改变，发挥抗抑郁作用。参与调节CREB的各调节因子之间、通路之间存在复杂的交叉联系和相互作用，共同维持着CREB活性的平衡。近年来研究提示：抑郁模型小鼠，存在神经元蛋白和

21、营养因子在海马的表达异常，而这些变化可以被一些中药逆转44。当前致力于阐明信号通路、CREB、营养因子、神经再生之间是如何相互联系的，以及细胞靶点、分子应答、行为反应的调节与抗抑郁之间错综复杂的关系。这将有助于我们以CREB为中心了解抑郁症的病理生理机制，并在此基础上研发出疗效可靠、起效迅速、副作用小、经济实用的新药，尤其是帮助我们更好地认识一些中药抗抑郁的可能机制，更充分地利用祖国宝贵的中医药资源。细胞内信号转导通路是目前抗抑郁机制研究的重点和热点。可被多种不同的信号路径激活。环磷酸腺苷（cAMP）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、钙调蛋白激酶（CaMK）等3条通路是目前认为与抗抑郁相关、最

22、主要的信号通路，这3个主要上游通路最终都使CREB磷酸化，进而调节其下游通路的基因表达，完成神经元生化功能，而CREB是上述3种通路的交汇点。前期的研究证实：百合知母汤抗抑郁的机制与提高慢性不可预见性应激结合孤养抑郁（CUMS）模型大鼠海马组织5-HT含量、提高脑组织中CREB（cAMP反应元件结合蛋白）mRNA的表达有关（见7.3）。有鉴于此，我们提出假设：百合知母汤抗抑郁的信号机制可能与以上三种细胞内通路有关，三个通路在抗抑郁机制中可能会有所偏重。围绕假设，基于CREB磷酸化通路，本课题拟将百合知母汤作用于CUMS大鼠，运用ELISA、RT-PCR、免疫组化、Western 印记等方法，检

23、测大脑组织cAMP信号中cAMP和PKA、MAPK信号中TrKB和BDNF、CaMK信号中钙调蛋白(CaM)和CaMK等关键因子，初步探讨百合知母汤抗抑郁的信号机制,筛选出该方抗抑郁的基因靶点。 2. 立题依据 中药复方具有成分多、作用环节多、靶点多的特点，多环节之间具有协同效应。因此研究中药及其方剂的抗抑郁作用具有极大的挖掘潜力，而且对解决日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社会意义45-46。四 研究内容及目标1.建立慢性不可预见性应激结合孤养大鼠抑郁（CUMS）模型；2.通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A(PKA)含量变化，评价百合知母汤对抑郁症cAMP信

24、号的干预作用；3.通过检测用药前后模型动物大鼠络氨酸激酶受体B（TrKB）和脑源性神经营养因子（BDNF）含量变化，评价百合知母汤对抑郁症MAPK信号的干预作用；4.通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织中钙调蛋白（CaM）和钙调蛋白激酶（CaMK）含量变化，评价百合知母汤对抑郁症CaMK信号的干预作用； 五 拟解决的关键问题 通过检测cAMP、MAPK、CaMK三条信号转导路径上重要调节因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用药前后的变化，初步评估百合知母汤对以上三个信号转导路径的干预作用，评价方剂抗抑郁的机制，以便进一步筛选出方剂抗抑郁靶点。六 实验研究方案1.实验动物S

25、D雄性大鼠，712周龄，体重180200g2.药物制备 按照金匮要略中记载的方法：百合七枚(劈)(约20g)，知母三两(切)(约10g)即百合：知母=2:1。取百合100g，知母50g，先以清水将百合浸泡12小时，当白沫出，去其水，再加清水2000ml，武火煎开后改为文火，得百合煎煮液1000ml；再用清水2000ml，先武火后文火，得知母煎煮液1000ml；将2次煎煮液混合，文火浓缩得煎煮液1500ml。按照比例配制足够数量百合知母汤煎煮液，放入冰箱-20储存备用。临用时取出，浓缩至合适体积。为确保实验结果的可比性，所有实验都用同一批药材。所有药物的给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂

26、量比率表”计算而来：大鼠（200g）用药量=人（70kg）日用剂量*0.018。每只大鼠的给药体积为1ml/100g。百合知母汤终浓度为2.2g/Kg/d（成人日用量30g）氟西汀终浓度为1.8mg/kg/d（成人日用量20mg）各组按浓度给药28天，对照组给等体积的三蒸水。3.CUMS抑郁症模型大鼠制备 除正常对照组外，其余动物采用慢性轻度不可预见性温和刺激结合孤养（CUMS）的造模方法：各造模组大鼠均单笼饲养，刺激因子包括禁食、禁水、4冰水游泳、夹尾、晃尾、潮湿垫料和倾斜45、束缚应激、陌生物品、空笼刺激、噪音刺激、闪光刺激、水平震荡、昼夜颠倒等。每日随机给予2到3种刺激，使大鼠不能预料刺

27、激的发生以避免产生适应。每种刺激交叉累计使用2-3次，持续21天，造模成功后，给药期间继续维持造模。建立慢性温和不可预见性应激结合孤养（CUMS）抑郁症大鼠模型,具体操作方法如下：(1)禁水：即24小时不予供水。具体方法为,造模当天,上午8:00始,撤出大鼠笼内供水瓶,禁水24小时后,于次日上午8:00正常供水。(2)禁食：即24小时禁止进食。具体方法为,造模当天上午8:00始,清除鼠笼内所有鼠粮,剥夺进食24小时后,禁食期间供水正常。禁食后给少量碎食,然后正常词养.(3)昼夜颠倒：造模当天,上午8:00,将正常对照组大鼠转移至其它SPF级实验室后,关闭本实验室所有电源,模仿黑夜,至20:00

28、准时打开实验室电源,模仿白昼,给大鼠制造昼夜颠倒的假象。(4)夹尾：用缠裹有胶布的塑料夹,夹持鼠尾根部,时长为5min。(5)晃尾：提住大鼠尾巴中部以每秒钟1次的频率,晃尾15分钟,晃尾时力度要轻柔,避免牵拉大鼠尾尖部位,以防脱皮(6)冰水游泳：取一直径为30cm玻璃缸,注入适量清水后加入适量冰块,调整水温至4(根据天气情况,适当调整,以防冻伤),同时调整水液平面据器皿边缘约15-20cm,然后将大鼠放入冰水中,强迫其游泳5min。5min后将大鼠榜出,先用干毛巾擦拭动物毛发,然后用吹风机吹干,避免感冒。每次冰水游泳结束后需捞干净游泳器皿内大鼠类便,避免对下一只鼠产生影响。（7）高速水平震荡：

29、将动物放入空的鼠笼中，进行人工振荡，2 次/秒，有效节奏连续持续 5min；或者水平晃动，1次/秒，持续30分钟（8）噪音刺激：90分贝噪音刺激2h，尽量选在白天大鼠休息的时候给予此种刺激。（9）束缚刺激：将大鼠束缚于500ml烧杯中2h，注意保持通气。（10）潮湿环境：将大鼠的垫料换以潮湿垫料，持续刺激12h。（11）异物刺激：往大鼠笼内放置金属条棒，钝性玻璃器皿的异物予以刺激，持续2h。（12）空 笼：撤掉大鼠笼里面的垫料笼子里不放置任何物品，持续12h。 （13）倾斜刺激,：该刺激因素通常在禁水后进行,应激动物本身饥渴,在倾斜的鼠笼中觅食觅水更为困难。（14）闪光刺激：LED频闪灯，频闪

30、频率2次/s，持续刺激2h。 以上各种刺激的实施顺序遵循由弱(轻刺激,如昼夜颠倒、禁水禁食、潮湿环境)到强(重刺激,如冰水游泳,夹尾，晃尾，束缚刺激，噪音，闪光等刺激)的原则,以避免刺激之间的交互作用。每日采用1种刺激,平均每种刺激被采用23次,同种刺激不能连续出现,使动物不能预料刺激的发生。4.行为学指标的测量 主要包括 1%蔗糖水消耗率、体重变化率、敞箱实验、Morris 水迷宫实验以及悬尾试验。4.1体重变化率分别在实验的第 1d、15d、22d、29、36d 、43d、50d、57、64d进行。动物体重变化率(%)=(当日测量的体重-第1天的体重)/第1天的体重。4.2糖水消耗实验实验

31、前期准备，在安静的环境内训练动物适应含糖饮水：第一个24h，每笼同时放置两个完全相同的动物水瓶，两瓶均为同等重量的1%蔗糖水；第二个24 h， 一瓶为1%鹿糖水,一瓶为相同重量的纯净水。然后进入实验阶段，禁水禁食24h后,测定9p.m-7a.m 10小时内大鼠1%蔗糖水摄入量。糖水偏爱率% =糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)X100%。适养期间进行三次糖水偏爱筛选,将糖水偏爱率异常的大鼠剔除,不用于正式实验(三次糖水偏爱测试中均只喝自来水的大鼠为异常大鼠)。测定动物在实验第1天、第22天、第49天、第64天糖水偏爱率的变化。4.3 敞箱实验敞箱实验(Open-field Test )是评

32、价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在陌生环境中某些行为的发生频率和持续时间来反应实验动物的自主行为与探究行为,以尿便次数反应其紧张度。敞箱实验(Open-field Test):木质敞箱,立方形,长、宽、高为80cm x 80cm x 40cm,内侧壁、底面为黑色,底面用白线划分为面积相等的25块正方形。室内安静环境下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内,人距离敞箱1米之外,记录大鼠在3 min内活动频率。以穿越底面正方形块数为水平穿越格数(4爪均进入方格才记数,为水平运动得分)、以两后肢直立的次数为竖立活动次数(两前爪腾空或攀附墙壁,为垂直运动得分),理毛次数

33、以及大小便次数。每只动物只测1次,测定完毕后彻底清洁敞箱再进行下一只观察。分别于实验前1天、实验第22天和最后1天进行。4.4 Morris 水迷宫实验该实验是对大鼠学习记忆能力的检测，主要包括定位航行实验和空间搜索实验。实验用主要装置包括一个银灰色圆形水池（直径 150cm），一个白色平台（直径10cm），一台跟踪摄像机以及与摄像机相连的计算机，池内盛水，且水温保持在 22-24。最后一次敞箱实验结束后第二天开始，首先训练大鼠寻找平台，平台置于水面下 2cm，摄像机位于水池上方约 200cm，能清晰摄取到大鼠的运动轨迹。将水池分为四个象限，将大鼠从任意一个象限放入水中，记录其找到平台的路径及

34、时间，前几次训练中，若时间超过 120s，则引导动物到平台，并在平台上停留10s。然后进行定位航行与空间搜索实验。定位航行实验：训练结束后的第一天，保持平台位置不动，将大鼠随机从一个象限放入水中，开始记录大鼠的运动轨迹及找到平台的时间；空间搜索实验：定位航行实验结束后，将平台撤走，将动物从原平台位置的对侧放入，开始记录 120s 内大鼠的运动轨迹及潜伏期与穿越平台次数。以此做为对空间记忆能力的检测指标。4.4 悬尾实验将实验动物通过固定动物尾端2cm处使其头向下悬挂，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，记录处于该环境的动物产生绝望的不动

35、状态的时间。动物表现出的这种典型的“不动状态”，反映了一种被称之为“行为绝望状态”，这种行为绝望模型与抑郁症类似，而且对绝大多数抗抑郁药物敏感，而且其药效与临床药效显著相关。5. 尼氏染色 正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏小体，它们主要分布于神经细胞的浆中，形状有大有小，如三角形，有的为椭圆形。这些物质能被大部分的蓝色染料所染色，这些染料如焦油坚牢紫（Cresylfastviolet）、亚甲蓝（methyleneblue）、甲苯胺蓝（toluidineblue）、硫董（thionin）等将其染为蓝色。但是，当神经细胞受伤后，胞质内的尼氏体更可发生变化，严重的可消失，通过观察尼氏小体的数量可以

36、探知神经元的受损或修复情况。各组大鼠分别于末次给药后麻醉,使大鼠仰卧位固定于实验台上,打开腹腔,掀起右肺,在靠近脊柱处找出下腔静脉和腹主动脉。用止血钳夹住腹主动脉和下腔静脉,接着打开胸腔,用针头经左心室插入升主动脉,后剪开右心耳,进行灌注。先用0.9%的生理盐水250ml经心脏快速灌注冲洗,再用4%的低聚甲醛,O.lmol/L的磷酸缓冲液(PH7.2-7.4)350ml灌注。在灌注固定液过程中后期大鼠颈部、肩部和双前肢逐渐变硬。灌注后取大鼠全脑,10%低聚甲醛固定48-60h。以松果体为标志物,向头侧横向切取3段,每段厚2mm。石蜡包埋,连续切片,片厚lOpin,切片,用于尼氏染色及后期的免疫

37、组化。将脑片置于0.5%甲苯胺蓝（母液：甲苯胺蓝1g，无水乙醇100ml。使用时按1:1比例与新鲜的0.1%NaCl溶液混合成工作液）或焦油紫（焦油紫0.1g；蒸馏水99ml；1%冰醋酸1ml）中室温下染色30min。在75%、95%、100%酒精中各脱色1min，二甲苯透明10min，中性树胶封片。显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数。6.测量生化指标主要包括CREB、BDNF mRNA在大鼠海马内的表达；免疫组化检测TrKB、ERK1/2蛋白的表达；免疫印迹法检查CaM、CaMK的表达。6.1逆转录-聚合酶链式反应法检测CREB、BDNFmRNA在大鼠海马内的表达首先匀浆：海马新

38、鲜组织约100mg,加入1ml的TRIZOL试剂,用电动勾浆器进行勾浆；两相分离:分装后样品于15到30孵育5分钟。每1ml的TRIZOL试剂勾浆的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15-30孵育2到3分钟。4下12000 g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色紛氯仿相,中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中,水相的体积大约是勾浆时加入的TRIZO试剂的60%；RNA沉淀:将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入，1mlTRIZOL试剂加0.5 ml的异丙醇，混勾后15-30孵育10分钟后

39、,于4 12,000g离心10分钟；RNA清洗:移去上清液,每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇,清洗RNA沉淀。振荡后,4，7500g离心5分钟；重新溶解RNA況淀:去除乙醇溶液,空气中干燥RNA沉淀5-10分钟,切勿真空离心干燥，注意RNA沉淀不要完全干燥,否则将大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6;溶解RNA时,先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次,然后55-60孵育10分钟。莰得的RNA溶液保存于-70；浓度测定:取少量液体用TE稀释(一般1: 100稀释)后,读取其在紫外分光光度计260nm和280nm处的吸收值,A2

40、60下读值为1表示40ugRNA/ml;样品RNA浓度(ug/ml)=A260稀释倍数40ug/ml；RNA纯度检测:RNA溶液的A260/A280的比值范围应在1.8-2.1之间；在无核酸酶的离心管中配制反应液： RNA，1-5g；逆转录引物 (20um)，1l；RNase free H2O，使总体系为12.5l(反应液配制在冰上进行)。轻轻混匀,65变性10min，立即置于冰上2min后加入：RNA-primer mix，12.5l；5RT Reaction Buffer ，4l；dNTP（10mM），2l；RiboLock RNase Inhibitor ，0.5l；RevertAid

41、Reverse Transcriptase，1l。总体系20l，25孵育10min后42孵育60min，70加热灭活10 min，-20保存。设计相应的引物，配制成合适浓度工作液，Real time-PCR仪反应体系液配制：2X all-in-OneTM qPCR Mix（含ROX），10l；引物（10pmol/l），上下游各0.4l；ddH2O，4.2l；cDNA（适度稀释） ，5l。总体系20l。反应条件：95，10min,以下反复40个循环;95,10s;60，20s;72，20s。最后结果采用2-CT法进行测量。6.2免疫组化法检测TrKB、ERK1/2的表达 切片后,常规脱蜡至水;3

42、%过氧化氢孵育lOmin,可以灭活内源性酶的活性,蒸水冲洗,5minx3次;微波热修复3min,PBS冲洗,5minx3次;滴加5%BSA封闭液,室温孵育30min;滴加一抗,5-HTiaR 一抗稀释为1:50,PKA稀释为1:100,CREB稀释为1:100,4C过夜,PBS冲洗,5minx3次;滴加二抗生物素标记的羊抗兔IgG,37C孵育30min,PBS冲洗,5minx3次;滴加三抗试剂SABC,37C孵育30min,PBS冲洗,5minx3次;DAB显色剂显色,室温下15inin,蒸馈水冲洗,脱水,透明,封片最后DAB 显色剂显色，室温下20min，蒸馏水终止反应，常规脱水、透明、封片

43、，显微镜下观察。每只动物取相同部位的3张切片，每张切片选取3个视野，在同一放大倍数、同一光强度下，采用CMLAS 彩色病理图像分析系统，分别计算每张切片中海马组织TrKB、ERK1/2表达的平均光密度。6.3免疫印迹法测定钙调素（CaM）、钙调蛋白激酶（CaMK）蛋白表达变化 取新鲜海马约100mg置1.5mlEP管中，生理盐水冲洗两遍，充分剪碎，离心去上清。每管加裂解液1ml，继续剪碎、混匀，低温超声匀浆；14000转离心，5min，取上清备用。取上清5l，加考马斯亮蓝3l，去离子水95l，595nm 处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管OD值；根据样品OD值调整蛋白浓度。样品煮沸5min，冷

44、却后取50g上样；电件（12浓缩胶：90v30min；10分离胶：120v120min）；NC膜转印（70v120min）；5脱脂奶粉TBST溶液封闭抗体，摇床2h，TBS漂洗5min，3次。一抗孵育（兔抗人CaM、CaMK多克隆抗体1:500稀释），4过夜；二抗孵育（辣根酶标记羊抗兔IgG 1:1500稀释），37 1h；扫描并分析结果，条件设置为曝光2min，CCD自动获取图像，同时以1:1000稀释的小鼠抗大鼠beta-actin单克隆抗体作为内参照，各蛋白相对表达量以相应蛋白beta-actin灰度值表示。 七 技术路线图百合知母汤水煎液制备 CUMS抑郁症模型大鼠抗抑郁作用体重糖水消

45、耗敞箱试验Morris水迷宫悬尾实验BDNFCREBmRNA表达CaMCaMK蛋白表达灌注固定，病理切片海马组织匀浆尼氏染色免疫组化CaMCaMK蛋白表达机制研究数据整理、分析、明确百合知母汤抗抑郁作用及相关分子机制 八 可行性分析1. 前期研究基础：本项目的前期工作已经成功复制了CUMS抑郁症动物模型，证实了百合知母汤能增加抑郁症动物3分钟穿格数、3分钟直立次数、修饰次数、大便粒数等行为学指标；能提高脑组织CREBmRNA的表达水平。为本课题的研究打下了坚实的基础。2. 人员配备及实验设施基础：本课题思路清晰、目标明确。拟在湖北中医药大学湖北中医药大学“中药资源与中药复方省部共建教育部重点实

46、验室”“国家中医药管理局中药药理三级实验室”实施，实验室仪器设备和人员配备完善，具备药理学、药物化学和分子生物学研究的相关设备与精密仪器，能满足本申请项目使用需要。3. 本课题所需的实验条件，动物实验室均具备。4. 本课题所涉及的主要技术和方法已初步掌握。5. 实验所需试剂均可在国内够得。 九 课题创新性1. 本课题首次系统地由宏观到微观地进行综合研究，能从行为学水平细胞形态水平分子水平三个层次经行分析，以期待比较完善地探索百合知母汤抗抑郁功效及其机理。2. 本课题选用了先进的指标，并且采用蛋白水平和mRNA水平检测方法，检测神经营养因子及相关细胞内信号转导通路中关键因子的变化，以期探寻本方提

47、高抑郁症大鼠脑组织CREBmRNA的表达水平的进一步信号转导机制。十 预期结果1. 成功完成大鼠抑郁症CUMS模型的建立，构建良好的实验平台。2. 探讨百合知母汤抗抑郁机制中三种信号转导系统发挥的作用，筛选百合知母汤抗抑郁的靶点通路。3. 预计在国内学术期刊上发表论文2篇。科 目总预算经费计算依据与说明一研究经费1.科研业务费4.0（1）测试/计算/分析费2.6酶联免疫吸附、分子生物学等指标的检测（2）能源动力费0.2水电动力费用（3）会议费/差旅费0.5（4）出版物/文献/信息传播费0.5论文发表版面费（5）其它（请注明）0.2资料及查新2. 实验材料费3.2（1）原材料/试剂/药品购置费3

48、.4实验动物0.4检测试剂盒2.4耗材0.6二.劳务费0.2研究生劳务费及误餐费用三.管理费0.4按照规定提取5%合 计8.0 十一 课题经费预算单位：万元 参考文献1吴炫静. 抑郁症的中医辨证治疗研究D.北京：中国中医科学院. 2008:15-23.2孙旭海.中医精神疾病分类与症状的古代医学文献整理研究D.北京:中国中医科学院. 2007: 1-2.3吴崇胜. 抑郁症中医症候诊断标准研究D.北京:北京中医药大学. 2006:19-21.4Nemeroff CB. The neurobiology of depressionJ. Scientific American， 1998， 278:4

49、2.5周学东，陈兴宝.抑郁症经济负担研究进展J.上海医药，2006， 27(12):539-5416周庚生，胡纪明.中西医临床精神病学，中国中医药出版社，1998:3167汤久慧. 中医药抗抑郁实验研究现状J. 河南中医， 2014， 34(7): 1248-12508张丽萍，颜红，侯冬芬.心身医学中医研究进展J.天津中医药大学学报，2008，27（3） ：206-208. 9Andrade L, Caraveo-duaga JJ, Berglund P, et al. The epidemiology of major depressive episodes:results from the

50、 International Consortium of Psychiatric Epideraiology(ICPE)SurveysJ. International Journal of Methods in Psychiatric Research,2003, 12:3-2110Kessler RC. Epidemiology of depression in the Asia pacific regionJ. AustralasianPsychiatry,2004, 12(suppl):4-1011Kessler RC. Epidemiology of women and depress

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