实验四血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳PPT课件

1、2021年4月30日星期五1 cellulose acetate membrane electrophoresiscellulose acetate membrane electrophoresis 实验四实验四 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 2021年4月30日星期五2 【实验目的实验目的】 F 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 F 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义 2021年4月30日星期五3 电泳：电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象带电粒子在电场的作

2、用下，向着与其电性相反的电极移动的现象 电泳技术电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术 【实验原理实验原理】 2021年4月30日星期五4 Pr C O O - N H 2 Pr C O O - N H 3 + Pr C O O H N H 3 + H OH H OH pHpI pH=pI pH 纤维状分子纤维状分子 Q Q越多，越多，u u越大；越大； 分子小，分子小，r r越小，越小，u u越大；越大； 2021年4月30日星期五7 2.2.缓冲溶液：缓冲溶液： pHpH值：值：(pH-pI)(pH-pI)越大，越大，Q Q越多，越多，u

3、u越大越大 离子强度离子强度(I)(I)： I I越大，电动电势越小，越大，电动电势越小，u u越小；越小； I I越小，电动电势越大，越小，电动电势越大，u u越大，越大， 但样品易扩散。但样品易扩散。 离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pHpH恒定恒定 选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.020.020.20.2之间。之间。 VQ u= X6r 2021年4月30日星期五8 电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也

4、称电势梯度。 3.3.电场强度电场强度(X)(X) X X越大，越大，u u越快。越快。 支持物越短，支持物越短， X X越大，越大， u u越快。越快。 电场强度越大或支持物越短，电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。电流将随之增加，产热也增加，影响分离效果。 在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋白质等样品发生热变 性而无法分离性而无法分离 VQ u= X6r 2021年4月30日星期五9 4.4.支持介质：支持介质： 纤维薄膜纤维薄膜( (玻璃纤维薄膜，醋酸纤维薄膜玻璃纤维薄膜，醋酸

5、纤维薄膜) ) 凝胶凝胶( (琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶) ) 2021年4月30日星期五10 负极 正极 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快；如果样品原本是移向负极的，则泳动的速度加快； 如果样品原本是如果样品原本是移向正极的，则泳动的速度减慢。移向正极的，则泳动的速度减慢。 电渗作用电渗作用： 电渗：电渗：在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。 以纸电泳为例以纸电泳为例: 2021年4月30日星期五11 区带电泳的分类区带电泳的分类 （一）支持物物理性状（一）

6、支持物物理性状 1 1滤纸及其它纤维滤纸及其它纤维( (如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜维薄膜) )电泳电泳 2 2粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳；粉末电泳：如纤维素粉、淀粉电泳； 3 3凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳； 4 4丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。丝线电泳：尼龙丝、人造丝电泳。 2021年4月30日星期五12 （二）支持物装置形式：（二）支持物装置形式： 1 1平板式电泳：支持物水平放置；平板式电泳：支持物水平放置； 2 2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；垂直板式电泳：

7、聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳； 3 3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳 2021年4月30日星期五13 ( (三三)pH)pH连续性：连续性： 1 1连续连续pH pH 电泳：即整个电泳过程电泳：即整个电泳过程pH pH 保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳 等。等。 2 2非连续非连续pH pH 电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH pH 的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘 状电脉，等电聚焦电泳等状电脉，等电聚焦电泳等 2021年4月30日星期五14 F

8、醋酸纤维薄膜为支持物醋酸纤维薄膜为支持物 F pH=8.6pH=8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液 F 血清蛋白的血清蛋白的pIpI均小于均小于8.68.6 F 负电荷负电荷 F 电泳时向正极移动电泳时向正极移动 F 由于迁移率不同而被分离由于迁移率不同而被分离 2021年4月30日星期五15 2 2 1 1清蛋白清蛋白 F 分子越小，泳动速度越快分子越小，泳动速度越快 F 带电量越多，泳动速度越快带电量越多，泳动速度越快 2021年4月30日星期五16 膜条经过氨基黑膜条经过氨基黑10B10B染色后显出清晰色带。染色后显出清晰色带。 2.2.定性定性, ,定量定量 各色带蛋白质含量与染料结合

9、量基本成正比。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 2021年4月30日星期五17 醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜： 醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜 广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析 血清蛋白、血红蛋白、球蛋白血清蛋白、血红蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、类固醇及同工酶等甲胎蛋白、类固醇及同工酶等 2021年4月30日星期五18 优点：优点： 简单快速简单

10、快速 缺点缺点 分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率较低（聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGEPAGE） 不适于制备（薄膜厚度约不适于制备（薄膜厚度约1010100m100m，样品用量很少），样品用量很少） 2021年4月30日星期五19 【器材及试剂器材及试剂】 1 1、器材：、器材： 醋酸纤维薄膜（醋酸纤维薄膜（2 28cm8cm） 常压电泳仪常压电泳仪 竹镊竹镊 点样器点样器 人血清或鸡血清人血清或鸡血清 粗滤纸粗滤纸 2 2、试剂：、试剂： 巴比妥缓冲液巴比妥缓冲液 氨基黑氨基黑10B0.2510B0.25染色液染色液 漂洗液漂洗液 透明液透明液 2021年4月30日星期五20 操作操作 （

11、一）仪器与薄膜的准备（一）仪器与薄膜的准备 1 1、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择、醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 2.2.电泳槽的准备电泳槽的准备 3 3、电极槽的平衡、电极槽的平衡 2021年4月30日星期五21 （二）点样（二）点样 取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上取出薄膜，无光泽面向上平放在滤纸上 点样区距阴极端点样区距阴极端1.5 cm1.5 cm 血清均匀涂在点样器表面血清均匀涂在点样器表面 将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内将点样器轻轻印在点样区内，使血清完全渗透至薄膜内 形成一定宽度、粗细均匀的直线形成一定宽度、粗细均匀的直线 实验的关键实验的关键，是获得具有清晰区带的

12、电泳图谱的重要环节，是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节 2021年4月30日星期五22 （三）电泳（三）电泳 点样端薄膜平贴点样端薄膜平贴阴极阴极电泳槽支架滤纸桥电泳槽支架滤纸桥 ( (点样面朝下点样面朝下) ) 另一端平贴在另一端平贴在阳极阳极端支架端支架 要求：要求：薄膜薄膜紧贴紧贴滤纸桥并滤纸桥并绷直绷直，薄膜之间相隔几毫米，薄膜之间相隔几毫米 盖电泳槽盖，平衡盖电泳槽盖，平衡10min10min 打开电源开关，调节电流强度为打开电源开关，调节电流强度为0.3mA/0.3mA/片，通电片，通电10min10min 调节电流强度为调节电流强度为0.5mA/0.5mA/片，电泳片，电泳6

13、06090min90min 电泳后调节旋钮电流为电泳后调节旋钮电流为O O，关闭电泳仪切断电源，关闭电泳仪切断电源 2021年4月30日星期五23 DYY-5DYY-5型稳压型稳压 稳流电泳仪稳流电泳仪 DYY-DYY-型型 电泳槽电泳槽 2021年4月30日星期五24 2021年4月30日星期五25 2021年4月30日星期五26 【实验注意事项实验注意事项】 不要用手触摸纤维素膜不要用手触摸纤维素膜 注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面注意区分醋酸纤维素薄膜的光面和毛面 点样位置要在点样位置要在1.51.5厘米以内，不要距边缘太近厘米以内，不要距边缘太近 不要重复点样不要重复点样 膜放进电泳

14、槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极膜放进电泳槽时，将点样面向下，点样端靠近阴极 2021年4月30日星期五27 用点样器点样时不要点的太多，但也不能太少用点样器点样时不要点的太多，但也不能太少 线条均匀，用力水平。线条均匀，用力水平。 电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液电泳槽放膜条支架上尽量不要有缓冲液 2021年4月30日星期五28 （四）染色和漂洗（四）染色和漂洗 取出薄膜，直接浸入染色液中，染色取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 min5 min 自来水冲洗，漂洗液漂洗自来水冲洗，漂洗液漂洗 更换更换3 3次漂洗液，脱去颜色，得到色带清晰的电泳图谱次漂洗液，脱去颜色，得到色带清晰的电泳图

15、谱 2021年4月30日星期五29 【实验结果实验结果】 绘出电泳图谱并标明各条带含义绘出电泳图谱并标明各条带含义 2021年4月30日星期五30 2021年4月30日星期五31 临床意义临床意义 血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量血浆蛋白是血浆最主要的固体成分，含量606080g/L 80g/L 绝大部分由肝脏合成，仅绝大部分由肝脏合成，仅球蛋白由浆细胞合成球蛋白由浆细胞合成 正常值：正常值： 白蛋白白蛋白57577272 ，1 1球蛋白球蛋白2 25 5 2 2球蛋白球蛋白4 49 9，球蛋白球蛋白6.56.51212 球蛋白球蛋白12122020 2021年4月30日星期五32 可能相

16、关疾病可能相关疾病清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 骨髓瘤骨髓瘤* * 肾病综合症肾病综合症* * * 肾炎肾炎* * 肝硬化肝硬化* * 急性肝坏死急性肝坏死 * * 传染性肝炎传染性肝炎* * * 急性感染初期急性感染初期* * * * 慢性炎症慢性炎症/ /感染后期感染后期* * 低低 球蛋白血症球蛋白血症* * 临床上还可用临床上还可用A/GA/G比来表示清球蛋白的量的关系：比来表示清球蛋白的量的关系： 正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5 2021年4月30日星期五33 血浆蛋白的主要功能血浆蛋白的主要功能 维持血浆胶体渗透压维持血

17、浆胶体渗透压 调节血浆调节血浆pHpH值，维持酸碱平衡值，维持酸碱平衡 运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等 免疫作用免疫作用 2021年4月30日星期五34 白蛋白降低：白蛋白降低： 合成能力不足合成能力不足：肝功能下降：肝功能下降 合成原料不足合成原料不足：饥饿，腹泻，肿瘤晚期：饥饿，腹泻，肿瘤晚期 去路增加：去路增加：肾病综合症，严重烧伤，大出血等肾病综合症，严重烧伤，大出血等 消耗过多：消耗过多：糖尿病，甲亢等糖尿病，甲亢等 2021年4月30日星期五35 球蛋白增加：球蛋白增加： 感染，多发性骨髓瘤，自身免疫性疾病等感染，多发性骨髓

18、瘤，自身免疫性疾病等 球蛋白降低：球蛋白降低： 皮质功能亢进，免疫缺陷病皮质功能亢进，免疫缺陷病 2021年4月30日星期五36 肝病：肝病： A ,A ,2 2-G ,- G ,-G ,- G ,1 1- G , - G- G , - G，A/GA/G下降甚至倒置下降甚至倒置 肾病：肾病： 早期：早期：选择性蛋白尿，选择性蛋白尿，MwMw较小蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白较小蛋白质丢失，含量下降。如白蛋白 后期：后期：非选择性蛋白尿，非选择性蛋白尿，MwMw较小的蛋白质丢失，含量下降较小的蛋白质丢失，含量下降 分子量较大的蛋白质（如分子量较大的蛋白质（如- - 球蛋白）丢失，含量下降球蛋白）

19、丢失，含量下降 2021年4月30日星期五37 【实验思考实验思考】 1 1电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？电泳时，点样端置于电场的正极还是负极？为什么？ 2 2电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种电泳后，泳动在最前面的是何种蛋白质？各谱带为何种 成分？请分析原因成分？请分析原因 2021年4月30日星期五38 【常见问题及原因常见问题及原因】 1.1.电泳图谱不齐：电泳图谱不齐：点样时血清滴加不均点样时血清滴加不均 2.2.电泳图谱出现条痕电泳图谱出现条痕：点样后薄膜过干，或电泳槽密闭性不：点样后薄膜过干，或电泳槽密闭性不 良，或电流过大，造成水分蒸发薄膜干燥良，或

20、电流过大，造成水分蒸发薄膜干燥 3.3.分离不良：分离不良：标本滴加过多标本滴加过多 4.4.区带过于紧密：区带过于紧密：缓冲液离子强度大于缓冲液离子强度大于0.0750.075 2021年4月30日星期五39 5.5.区带拖尾：区带拖尾：缓冲液离子强度小于缓冲液离子强度小于0.050.05 6. 6. 染色后清蛋白中间色浅：染色后清蛋白中间色浅：染色时间不足，或清蛋白量过高染色时间不足，或清蛋白量过高 减少样品用量或延长染色时间减少样品用量或延长染色时间 2021年4月30日星期五40 膜条经过氨基黑膜条经过氨基黑10B10B染色后显出清晰色带。染色后显出清晰色带。 2.2.定性定性, ,定量定量 各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。 可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中。 用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。 2021年4月30日星期五41 醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜： 醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜醋酸纤维加工的细密且薄的微孔膜 广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析广泛应用医学临床各种生物分子的分离分析 血清蛋白、血红蛋白、球蛋白血清蛋白、血红蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、类固醇