复合叶酸-碳纳米管-紫杉醇的司盘-聚乙二醇超声对比剂微泡的制备

1、复合叶酸-碳纳米管-紫杉醇的司盘-聚乙二醇超声对比剂微泡的制备 中国组织工程研究 第21卷 第2期 20170118出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 18, 2017 Vol.21, No.2 www. CRTER.org ， 研究原著 刘俊希1，张 杰12，张 宇1，赵 越1，万国靖3，李国忠2 (1佳木斯大学黑龙江药学研究所，黑龙江省佳木斯市 154007；2哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，黑龙江省哈尔滨市 150081；3武警黑龙江总队医院药剂科，黑龙江省哈尔滨市 150070) 国组织工程研究，201

2、7，21(2):260-267. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.02.018 ORCID: 0000-0002-4257-696X(张杰) 文章快速阅读： 文题释义： 功能化碳纳米管：采用浓酸回流法对碳纳米管进行羧基化；制备叶酸壳聚糖偶合物；通过壳聚糖将叶酸连接到羧基化的碳纳米管上，作为靶向因子；再将紫杉醇负载到叶酸修饰后的靶向碳纳米管上，制得靶向载药的碳纳米管复合物，实现碳纳米管的功能化。 复合超声对比剂微泡：采用声振空化的方法，制备以司盘和聚乙二醇为膜材、包覆功能化碳纳米管和氮气的复合微泡，经过洗涤和离心，得到粒径均一、性质稳定、空心结构的微泡。通过正

3、交试验优化制备工艺条件，最终制得具有增强超声显影潜力的复合功能化碳纳米管的超声对比剂微泡。 摘要 背景：传统超声对比剂功能单一，灵敏度、清晰度和准确度受客观影响因素较大，无法同时实现诊断与治疗的作用。碳纳米管呈特殊的网状中空管腔结构，具有增强显影的潜力，通过非共价吸附、共价键合及内部包埋等方法得到功能化碳纳米管，生物相容性好，药物负载率高。基于此，将载药的碳纳米管加入到超声对比剂微泡结构中，制备一种新型的复合碳纳米管运载体系的多功能超声对比剂微泡。 目的：制备复合叶酸-碳纳米管-紫杉醇(folate-carbon nano-tube-paclitaxel，FA-CNTs-PTX)的司盘-聚乙二

4、醇(Span-PEG)超声对比剂微泡，研究微泡的形貌、粒径、以及微泡中碳纳米管和紫杉醇的负载率。 方法：先采用声振空化法制备Span-PEG微泡，并通过正交实验优化制备工艺，再通过静电自组装、-吸附等原理合成FA-CNTs-PTX中间体。然后，将FA-CNTs-PTX中间体复合在Span-PEG微泡中，得到复合FA-CNTs-PTX的Span-PEG超声对比剂微泡。采用扫描电镜和透射电镜观察微泡的形貌，采用激光粒度分析仪测定微泡的粒径分布及平均粒径，采用紫外分光光度法测定微泡中碳纳米管和紫杉醇的负载率。 结果与结论：制备的复合FA-CNTs-PTX的Span-PEG微泡表面光滑、平均粒径为44

5、2 nm，微泡中碳纳米管和紫杉醇的负载率分别为1.69%和47.9%。成功将FA-CNTs-PTX靶向载药复合物包覆于Span-PEG微泡中，微泡为空心球体，粒径分布均匀且为纳米级别，该复合微泡有望成为一种集造影和靶向治疗为一体的超声对比剂。 关键词： 生物材料；纳米材料；超声对比剂；诊断；治疗；靶向；碳纳米管；静电自组装；紫杉醇；叶酸；国家自然科学基金 主题词： 超声学；纳米管, 碳；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金青年基金(81601616)；黑龙江省博士后基金(LBH-Z15164)；黑龙江省科学基金(H2016086)；佳木斯大学研究生科技创新项目(LM2015_091)；佳木斯

6、大学科技创新团队基金(CXTD-2013-05) 260 P.O. Box 10002, Shenyang 刘俊希，1990年生，黑龙江省肇源县人，汉族，佳木斯大学在读硕士，主要从事天然药物化学研究。 通讯作者：张杰，博士，讲师，佳木斯大学黑龙江药学研究所，黑龙江省佳木斯市 154007；哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科，黑龙江省哈尔滨市 150081 通讯作者：张宇，硕士，教授，佳木斯大学黑龙江药学研究所，黑龙江省佳木斯市 154007 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2017)02-00260-08 稿件接受： 2016-12-09 Liu Jun-

7、xi, Studying for masters degree, Pharmaceutical Research Institute of Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China Corresponding author: Zhang Jie, M.D., Lecturer, Pharmaceutical Research Institute of Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 15400

8、7, Heilongjiang Province, China; Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang Province, China Corresponding author: Zhang Yu, Master, Professor, Pharmaceutical Research Institute of Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154

9、007, Heilongjiang Province, China www.CRTER.org 110180 CRTER.org Preparation of span-poly(ethylene glycol) ultrasound contrast agent microbubbles combined with folate-carbon nano tube-paclitaxel Liu Jun-xi1, Zhang Jie1, 2, Zhang Yu1, Zhao Yue1, Wan Guo-jing3, Li Guo-zhong2 (1Pharmaceutical Research

10、Institute of Heilongjiang Province, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang Province, China; 2Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150081, Heilongjiang Province, China; 3Department of Pharmacy, Heilongjiang General Hospital of Arm Police Fo

11、rce, Harbin 150070, Heilongjiang Province, China) Abstract BACKGROUND: As the sensitivity, clarity and accuracy of traditional ultrasound contrast agents are easy to be affected by objective factors, it is difficult to achieve diagnose and therapy simultaneously. Carbon nano tubes (CNTs) possess a s

12、pecific reticular, hollow and tubular structure and the potential to enhance the ultrasound imaging. The functional CNTs obtained through non-covalent adsorption, covalent bonding and internal embedding hold a good biocompatibility and high drug loading efficiency. So the drug loaded CNTs are added

13、into the microbubble to synthesize a multi-functional ultrasound contrast agent. OBJECTIVE: To prepare the span-poly(ethylene glycol) (span-PEG) ultrasound contrast agent microbubble combined with folate-CNTs-paclitaxel (FA-CNTs-PTX) and to investigate its appearance, particle size as well as loadin

14、g efficiency of CNTs and PTX. METHODS: Firstly, the span-PEG microbubble was prepared using the acoustic cavitation method and its preparation process was optimized through the orthogonal experiment. Then the FA-CNTs-PTX compound was synthesized by the electrostatic self-assembly and - adsorption pr

15、inciple. In the end, the span-PEG ultrasound contrast agent microbubble combined with FA-CNTs-PTX was obtained by loading the FA-CNTs-PTX into the span-PEG microbubble. The appearance of the composite microbubble were observed using scanning and transmission electron microscopes, the distribution an

16、d average particle size were detected by laser particle size analyzer, and the loading efficiency of CNTs and PTX was measured through ultraviolet spectroscopy. RESULTS AND CONCLUSION: The composite microbubble had a smooth surface and the average particle size was 442 nm. The loading efficiency of

17、CNTs and PTX in the composite microbubble was 1.69% and 47.9%, respectively. To conclude, the FA-CNTs-PTX targeting drug delivery system is successfully loaded into the span-PEG microbubble. The composite microbubble is a hollow sphere that has uniform nanoscaled particle size distributions, which i

18、s expected to become an ideal ultrasound contrast agent involved in angiography and targeting therapy. Subject headings: Ultrasonics; Nanotubes, Carbon; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81601616; the Post Doctoral Foundation of Heilongjiang Province,

19、No. LBH-Z15164; the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. H2016086; the Scientific and Technologic Innovation Program for the Graduates of Jiamusi University, No. LM2015-091; the Scientific Innovation Group of Jiamusi University, No. CXTD-2013-05 Cite this article: Liu JX, Zhang J

20、, Zhang Y, Zhao Y, Wan GJ, Li GZ. Preparation of span-poly(ethylene glycol) ultrasound contrast agent microbubbles combined with folate-carbon nano tube-paclitaxel. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(2):260-267. 0 引言 Introduction 超声对比剂是超声分子成像技术的基础。从1968年Gramiak和Shah将吲哚青蓝染料注入犬心脏，在二维超声心动图上发现云雾状回

21、声增强后，超声造影技术从此揭开了新的篇章1-2。常规超声在超声组织定征上无法进行精确的判断，所以随着超声对比剂的不断发展，其增强组织回波能力开始受到极大关注。为增强其造影的功能，人们开始在超声对比剂的膜材上不断改进其稳定性和显影效果；后来又在其表面或内部携带药物、基因等3-6，这种特异性靶向超声对比剂经静脉注射后能实现富集靶向组织，从而通过超声显像手段诊断发现、跟踪监测活体中靶组织的病理变化过程及评价应用药物的疗效7-10。目前，研发制备的各种包载药物或基因的微泡，可实现超声对比剂的多功能多模态化，在达到增强显影的同时实现辅助治疗的作用，还可实现早期评价及预测肿瘤新化疗疗效。多功能的超声对比剂

22、现已经成为了国内外学者研究的热点11-16。但超声对比剂由于受自身材料及结构局限性的影响，还存在载药量受限、稳定性较差等缺点。 碳纳米管作为一种新型生物医学材料，特别是功能化 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 后的碳纳米管具有良好生物兼容性17-21，由于碳纳米管特有的中空结构优势，可通过非共价及共价作用对其进行改性。其中，非共价化学改性是通过分子间的Van der Waals力、氢键、疏水力、静电力及-键等弱相互作用对碳纳米管表面进行物理处理，几乎不破坏碳纳米管的电子结构，就能将药物分子镶嵌入碳纳米管内部22-26。可作为生物支架、载体，实现

23、跨细胞膜运输，也可以通过吸收近红外波放热用于治疗肿瘤细胞。目前已有研究将碳纳米管应用于超声成像，且获得增强超声显像和良好生物适应性等结果27-34。 作者拟将叶酸作为微泡的靶向因子，它能够与在多种肿瘤细胞内过度表达的叶酸受体特异性结合，目前广泛应用于靶向制剂的研究。所以作者通过壳聚糖将其连接到碳纳米管表面，再将临床应用较为广泛的紫杉醇负载于该碳纳米管体系中。紫杉醇作为较为成熟的抗肿瘤药物，对多种肿瘤细胞均有抑制作用，为抗微管类药物。制备叶酸-碳纳米管-紫杉醇(folate-carbon nano-tube-paclitaxel，FA-CNTs-PTX)靶向载药中间体；采用声振空化法将FA-CN

24、Ts-PTX中间体包载于以生物相容性较好的非离子 261 CRTER.org 型表面活性剂司盘(Span)和稳定性较好的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)为膜材的超声对比剂微泡内，微泡中包裹氮气，从而得到一种集造影和靶向治疗为一体的复合超声对比剂微泡。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 材料学研究。 1.2 时间及地点 实验于2015年6月至2016年4月分别在佳木斯大学药学院、哈尔滨工业大学及哈尔滨医科大学等完成。 1.3 材料 碳纳米管购自广州延瑞化工有限公司，紫杉醇、叶酸购自成都曼斯特生物科技有限公司，碳二亚胺盐酸盐(EDC

25、，纯度98%)购自Sigma公司，壳聚糖购自青岛海蓝生物制品公司，山梨醇酐单硬脂酸酯(Span 60)、PEG 1500、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、冰醋酸、浓硝酸、浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠购自天津市科密欧化学试剂有限公司，氮气购自哈尔滨市黎明气厂。光学显微镜购自重庆重光有限公司，扫描电镜(S4800HSD)购自日本日立公司，透射电镜(HF-3300)购自日本日立公司，激光粒度分析仪(ZS90)购自英国Malvern公司，红外光谱仪(AVATAR360)购自美国Nicolet仪器公司，紫外分光光度仪购自北京普析仪器通用仪器责任有限

26、公司，热重分析仪(TGA/SDTA851)购自瑞士Mettler-Toledo 公司。 1.4 方法 1.4.1 司盘-聚乙二醇(Span-PEG)微泡的制备 称取适量Span60、PEG 1500和NaCl，研磨分散后用PBS溶解，磁力搅拌分散均匀，探头超声，同时通入氮气。声振处理后的混悬液，离心，取上清置于分液漏斗中，加入等量PBS洗涤，取中层，得到Span-PEG空白微泡。转移至西林瓶中，充入氮气，密封后，轻摇混匀，于4 冰箱保存。 通过正交试验对不同膜材比例、制备温度、超声功率和超声时间进行优化，得到最佳制备工艺条件。 1.4.2 复合FA-CNTs-PTX的Span-PEG微泡的制备

27、 采用混酸加热回流法对碳纳米管进行官能化处理22-26，得到羧基化碳纳米管(carboxylic carbon nanotube，CNTs-COOH)。将EDC活化后的叶酸的二甲基亚砜溶液后加入到壳聚糖的醋酸溶液中，室温下避光反应。待反应结束后加入丙酮，沉淀完全后，离心；再分别用二甲基亚砜、蒸馏水洗涤，离心，重复2次，收集下层产物冷冻干燥，即得FA-CS偶合物(FA-CS)35。将FA-CS醋酸水溶液与CNTs-COOH混合，磁力搅拌，避光反应，抽滤，水洗涤至中性，冷冻干燥后得静电自组装的靶向复合物(FA-CNTs)。将FA-CNTs加入到紫杉醇的无水乙醇溶液中，避光反应，抽滤，乙醇洗涤，干燥

28、后得到靶向载药复合物(FA-CNTs-PTX)。 称取适量Span60、PEG 1500和NaCl，研磨分散后用PBS溶解，磁力搅拌分散均匀，将复合物FA-CNTs-PTX低 262 功率超声分散均匀后，滴加到均匀的混合膜材中，探头超声，同时通入氮气。声振处理后的混悬液，离心，取上清置于分液漏斗中，加入等量PBS洗涤，取中层得到复合FA-CNTs-PTX的Span-PEG微泡。转移至西林瓶中，充入氮气，密封后，轻摇混匀，于4 冰箱保存。采用光学显微镜、扫描电镜、透射电镜和激光粒度分析仪观察和测定复合微泡的形貌和粒径。采用红外光谱和热重分析仪分析FA-CS、FA-CNTs、FA-CNTs-PTX

29、中间体的化学成分。 1.4.3 复合微泡中碳纳米管和紫杉醇负载率的测定 碳纳米管含量测定：标准曲线的绘制：分别用PBS配制浓度分别为0.002 5，0.005，0.01，0.015，0.02， 0.025 g/L的碳纳米管混悬液，以PBS作空白对照，采用紫外分光光度仪在300 nm处测定各浓度碳纳米管溶液的吸光度，绘制碳纳米管标准曲线；精密度：精密量取碳纳米管标准品，配置成5，10，15 mg/L低中高三个浓度，每个浓度取6个平行样，计算平均浓度；加样回收率：取一定质量复合FA-CNTs-PTX微泡冻干粉，用PBS配制浓度为0.6 g/L的复合微泡混悬液，超声释药2 h，分为6组，每组设3个平

30、行样，每个试样10 mL。在300 nm处测定复合微泡中碳纳米管的吸光度，再向6组复合微泡中分别加入50，100，150，200，250，300 g的碳纳米管标准品，在 300 nm处测定各浓度复合微泡中碳纳米管的吸光度，计算碳纳米管回收率；复合微泡中碳纳米管负载率：取1 mg的复合微泡冻干粉，定容于10 mL PBS中超声释药2 h，紫外分光光度仪在300 nm处测定其吸光度，利用碳纳米管标准曲线计算碳纳米管的浓度，通过公式(1)计算复合微泡中碳纳米管负载率。 负载率? 复合微泡中碳纳米管的总浓度 复合微泡的总浓度 ?100% (1) 紫杉醇含量测定：标准曲线的绘制：分别配制浓度为0.025

31、，0.05，0.1，0.2，0.5 g/L紫杉醇的甲醇-N，N-二甲基乙酰胺(12)溶液，以甲醇-N，N-二甲基乙酰胺(12)溶液作空白对照，采用紫外分光光度仪在230 nm处测定各浓度紫杉醇溶液的吸光度，绘制 紫杉醇标准曲线；精密度：精密量取紫杉醇标准品，以甲醇-N，N-二甲基乙酰胺(12)溶液为溶剂，配置成100，200，300 mg/L低中高三个浓度，每个浓度取6个平行样，计算平均浓度；加样回收率：取一定质量的复合FA-CNTs-PTX微泡冻干粉，用甲醇-N，N-二甲基乙酰胺(12)溶液配制浓度为0.6 g/L的微泡悬浮液，超声释药2 h。经微孔滤膜过滤，滤液分为6组，每组设3个平行样，

32、每个试样10 mL。在230 nm处测定6组紫杉醇溶液的吸光度，再向6组复合微泡中分别加入1 000，2 000，3 000，4 000，5 000，6 000 g的紫杉醇标准品，在230 nm处测定吸光度，计算紫杉醇回收率；复合微泡中紫杉醇负载率：取1 mg复合微泡冻干粉，定容于10 mL甲醇-N，N-二甲基乙酰胺(12)溶液中超声释药 2 h。复合微泡混悬液经微孔滤膜过滤，取滤液，紫外分光光度仪 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER.org 在230 nm处测定吸光度，根据紫杉醇标准曲线计算紫杉醇浓度，通过公式(2)计算复合

33、微泡中紫杉醇负载率。 负载率?复合微泡中紫杉醇的总浓度 (2) 复合微泡的总浓度?100% 1.5 主要观察指标 合成的复合物中间体的结构表征；复合微泡形貌、粒径、结构；碳纳米管负载率；紫杉醇负载率。 1.6 统计学分析 各组实验独立重复3次，正交分析方法，采用Origin 9.0、Excel 2007和SPSS 22.0等统计软件进行处理分析所得的全部实验数据。 2 结果 Results 2.1 优化Span-PEG微泡的制备工艺 采用声振空化法制备Span-PEG微泡，不同膜材比例、制备温度、超声功率、超声时间条件下所制备 Span-PEG微泡形态见图1。各组微泡的粒径见表1。各因素的影响

34、大小顺序为：超声时间>制备温度>膜材比例>超声功率。最佳制备工艺为：膜材比例(Span与PEG质量比)12、制备温度70 、超声功率850 W、超声时间4 min。 膜材比例(Span : PEG质量比)12、制备温度70 、超声功率850 W、超声时间4 min条件下所制备的Span-PEG微泡见图2。这种Span-PEG微泡表面较为光滑，粒径较为均匀，平均粒径在500 nm左右。 2.2 复合物中间体 2.2.1 FA-CS偶合物 壳聚糖的红外光谱中在3 345 cm- 1 附近存在较宽的一段吸收峰，这是由于壳聚糖中O-H和N-H的伸缩振动叠加造成的，在2 920 cm-

35、1 和2 864 cm- 1 处出 现的是C-H伸缩振动吸收峰，在1 655 cm- 1和1 597 cm-1吸 收峰分别是C-N伸缩振动和氨基(-NH2)的特征峰(图3a)。叶酸的红外光谱中在3 547 cm- 1处出现叶酸中羟基(O-H)的 吸收峰，在3 419 cm-1和3 321 cm-1处吸收峰是由叶酸中氨 基、-NH的伸缩振动引起的(图3c)。FA-CS偶合物红外光谱中在3 436 cm- 1附近只有一个吸收峰，为仲酰胺的特征 峰，这是由于壳聚糖上的氨基基团与叶酸上的羧基基团(-COOH)发生静电自组装所致；在2 923 cm-1和2 868 cm-1 出现了壳聚糖中C-H伸缩振动

36、吸收峰；在1 655 cm- 1和 1 597 cm-1处的吸收峰明显减弱，在1 597 cm- 1 处的N-H 变形振动峰移动到了高频的1 628 cm- 135，这是由于 FA-CS偶合物中壳聚糖氨基被叶酸部分取代(图3b)。 FA-CS偶合物热分析如图4。由图4可见，偶合物在240-400 温度范围存在失重35-36，这是由于FA-CS不稳定，偶合物中壳聚糖在240 左右开始出现分解，至 400 左右分解完全，FA-CS中壳聚糖的质量分数为35%。 图3，4说明采用静电自组装成功合成了FA-CS偶合物。 2.2.2 羧基化碳纳米管 由图5可见，羧基化前后的碳纳米管均在波数1 550 cm

37、- 1处存在碳碳双键(C=C)的伸缩振动，这 是碳纳米管自身结构的振动吸收所致。羧基化前3 625 cm- 1 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 处吸收峰为-OH吸收峰(图5a)，是由于碳纳米管表面所吸附少量水分子所造成。羧基化后3 303 cm- 1附近的强宽峰谱带 为羧基中的-OH的伸缩振动产生的，在1 710 cm- 1处出现了 羧基中的C=O特征吸收峰，1 207 cm- 1处存在(C-O)伸缩振动 吸收峰35(图5b)，这是由于在混酸等强氧化剂作用下，碳纳米管表面带上了一定数量的羟基所引起，由此可知，经过混酸处理后的碳纳米管上连接上了

38、羧基基团。 羧基化碳纳米管热分析见图6。由图6可知，在100 左右发生失重，这是碳纳米管表面的水挥发所致。在400-600 范围发生的重量损失，失重率为26.6%左右，并且在500-600 范围存在放热峰，这是由于碳纳米管上存在羧基引起。 2.2.3 静电自组装产物(FA-CNTs)负载紫杉醇 由图3b，7a可知，静电自组装产物FA-CNTs在3 438 cm- 1处出现了 FA-CS中仲酰胺的特征峰；在1 740 cm-1处出现了一个小峰，此为酯键上的C=O伸缩振动峰；在1 630 cm- 1处为羧 基的C=O伸缩振动，这是由于FA-CS在1 628 cm- 1处的 N-H变形振动峰所致。这

39、说明已成功将FA-CS静电自组装至碳纳米管上。 紫杉醇的红外光谱中，在3 500 cm- 1附近的O-H伸缩振 动吸收峰与N-H伸缩振动峰重叠；在2 942 cm- 1处为苯环上 的C-H伸缩振动峰，在1 734 cm-1和1 713 cm-1处出现特征吸 收峰为酮羰基C=O的2个裂分峰，在1 645 cm- 1处为酰胺基的羰基峰，在1 500 cm- 1附近为苯环的骨架振动所产生的吸收 峰；在1 380 cm- 1处为甲基产生的C-H面内弯曲振动， 1 248 cm-1处为C-N键伸缩振动，在1 067 cm-1、 1 110 cm- 1 处为仲醇和叔醇中的C-O伸缩振动产生的吸收峰；在90

40、0-690 cm- 1处为苯环C-H的面外弯曲振动所产生的吸收 峰，其中715 cm- 1为紫杉醇单取代苯的特征峰(图7c)。 复合物FA-CNTs-PTX在3 438 cm- 1处的一个单峰，是图 7(a)FA-CNTs中仲酰胺的特征峰，在2 921 cm- 1苯环上的C-H 伸缩振动峰；在1 372 cm- 1处为紫杉醇甲基产生的C-H面内 弯曲振动吸收峰，在1 241 cm-1处为紫杉醇的C-N键伸缩振动吸收峰，在1 067 cm- 1处为紫杉醇的叔醇中的C-O伸缩振动 吸收峰；在713 cm- 1为紫杉醇单取代苯的特征峰产生的吸收 峰(图7b)。这些说明已成功将紫杉醇负载到FA-CNT

41、s上。 综上可知，成功得到复合物FA-CNTs-PTX。 2.3 复合FA-CNTs-PTX的微泡的制备结果 2.3.1 复合微泡形貌 图8为透射电镜下检测到的复合FA-CNTs-PTX的微泡形貌，内部为中空结构，膜层及其附近部分为黑色阴影区。 2.3.2 复合微泡的粒径分布 图9为复合FA-CNTs-PTX的 微泡粒度分布图，复合微泡平均粒径为442 nm，粒径分布较为集中，肿瘤微环境中丰富的小血管壁通常其结构是不完整的，其血管壁间隙通常在700 nm附近，可见复合 FA-CNTs-PTX的微泡尺寸具有靶向肿瘤的条件，为后期抗肿瘤实验提供了理论依据。 263 CRTER .org 图1 不同

42、条件下所制备 Span-PEG微泡(10 000) Figure 1 Span-poly(ethylene glycol) microbubbles prepared under different conditions ( 图注：图中为扫描电镜下的 10 000) Span-PEG微泡，其中A为膜材比例(Span/PEG 质量比)21，制备温度65 ，超声功率850 W，超声时间4 min ；B为膜材比例21，制备温度70 ，超声功率900 W，超声时间5 min；C为膜材比例21，制备温度75 ，超声功率 950 W ，超声时间6 min；D为膜材比例11，制备温度65 ，超 声功率 90

43、0 W，超声时间6 min；E为膜材比例11，制备温度75 ，超声功率 850 W，超声时间5 min；F为膜材比例11，制备温度75 ，超声功率850 W，超声时间5 min；G为膜材比例12备温度 ，制 65 ，超声功率950 W，超声时间5 min；H为膜材比例1 2，制备温度 70 ，超声功率850 W，超声时间6 min；I为膜材比例1 2，制备温度75 ，超声功率900 W，超声时间4 min。 T 0.02 mg 1 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100 图4 FA-CS偶合物的热重图 Figure 4 Thermogra

44、vimetry of the folate-chitosan composite TG 0.5 0.02 mg 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1 000 1 100 图6 羧基化碳纳米管热重图 Figure 6 Thermogravimetry of the carbon nano tube after carboxylation 264 图2 膜材比例(Span与PEG质量比)12、制备温度70 、超声功率850 W、超声时间4 min条件下制备的Span-PEG微泡(10 000) Figure 2 Morphology of the span-p

45、oly(ethylene glycol) microbubble (10 000) 图注：Span-PEG微泡表面较为光滑，粒径较为均匀，平均粒径在500 nm左右。 )(%率透射4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500 波长(cm-1) 图3 壳聚糖、FA-CS偶合物和叶酸的红外光谱图 Figure 3 Infrared spectrogram of chitosan, folate-chitosan composite and folic acid 图注：图中a为壳聚糖，b为FA-CS偶合物，c为叶酸。 )(%率透射4 000 3 500

46、3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500 波长(cm-1) 图5 碳纳米管羧基化前后的红外光谱图 Figure 5 Infrared spectrogram of the carbon nano tube before and after carboxylation 图注：图中a为羧基化前，b为羧基化后。 )(%透射率4 000 3 500 3 000 2 500 2 000 1 500 1 000 500 波长(cm-1) 图7 FA-CNTs、FA-CNTs-PTX和紫杉醇的红外光谱图 Figure 7 Infrared spectrogram of the fo

47、late-carbon nano tubes, folate-carbon nano tube-paclitaxel and paclitaxel 图注：图中a为FA-CNTs，b为FA-CNTs-PTX，c为紫杉醇。 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org CRTER.org 1 图8 复合FA-CNTs-PTX的微泡微观形态(100 000) Figure 8 Micromorphology of the microbubble combined with folate-carbon nano tube-paclitaxel ( 100

48、000) 图注：透射电镜下复合 FA-CNTs-PTX的微泡为中空结构，膜层及其附近部分为黑色。 表1 Span-PEG微泡正交实验表 Table 1 The orthogonal experiment list of span-poly(ethylene glycol) microbubbles 试验号 因素 试验结果 膜材比例 制备的温度 超声功率 超声时间 平均粒径 (Span : PEG质量比) () (W) (t) (nm) 1 21 65 850 4 957 2 21 70 900 5 751 3 21 75 950 6 1 190 4 11 65 900 6 1 570 5 11

49、 70 950 4 909 6 11 75 850 5 776 7 12 65 950 5 1 130 8 12 70 850 6 888 9 12 75 900 4 599 K1 2 898 3 657 2 621 2 465 K2 3 255 2 548 2 920 2 657 K3 2 617 2 565 3 229 3 648 K1 966 1 219 873 821 K2 1 085 849 973 885 K3 872 855 1 076 1 216 R 213 370 203 395 表注：正交试验结果得出各因素的影响大小顺序为：超声时间 >比例>超声功率。 制备温度

50、>膜材 最佳制备工艺为：膜材比例(Span与PEG质量比)12、制备温度70 、超声功率850 W、超声时间4 min。 表5 紫杉醇吸光度的精密度试验 (n=6) Table 5 paclitaxel The precision test results of the absorbance values of 次数 紫杉醇质量浓度(mg/L) 100 200 300 1 0.033 0.059 0.086 2 0.031 0.058 0.087 3 0.029 0.060 0.088 4 0.035 0.061 0.086 5 0.034 0.057 0.084 6 0.030 0.0

51、59 0.089 平均值 0.0330.001 0.0590.001 0.0860.002 相对标准偏差 2.17% 2.04% 1.84% ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 80 )%60 (度强40 号信20 0 1 10 100 1 000 粒径(nm) 图9 复合 FA-CNTs-PTX的微泡粒度分布图 Figure 9 The particle size distribution of the microbubble combined with folate-carbon nano tube-paclitaxel 图注：复合 FA-C

52、NTs-PTX的微泡粒度的平均粒径为442 nm。 表2 碳纳米管吸光度的精密度试验结果 (n=6) Table 2 The precision test results of the absorbance values of carbon nano tube 次数 碳纳米管浓度(mg/L) 5 10 15 1 0.171 0.363 0.559 2 0.169 0.361 0.557 3 0.175 0.370 0.550 4 0.170 0.365 0.552 5 0.168 0.364 0.548 6 0.173 0.359 0.560 平均值 0.1710.002 0.3640.003

53、 0.5540.005 相对标准偏差 1.39% 0.94% 0.82% 表3 碳纳米管加样回收率试验 表4 复合微泡中碳纳米管的吸结果 (n=6，%) 光度结果 (n=5) Table 3 The recovery test Table 4 Absorbance value of results of carbon nano tube the carbon nano tube in the composite microbubble 次数 碳纳米管回收率 1 98.00 次数 吸光度 2 98.01 1 0.69 9 3 99.33 2 0.64 3 4 99.56 3 0.65 3 5 1

54、00.80 4 0.64 5 6 99.34 5 0.64 4 平均值 99.160.96 平均值 0.65 7 相对标准偏差 0.97% 表6 紫杉醇加样回收率试验结 表7 复合微泡中紫杉醇吸光度 果 (n=6，%) Table 7 Absorbance value of Table 6 The recovery test the paclitaxel in the composite results of paclitaxel microbubble (n=6)microbubble(n=5) 次数 紫杉醇回收率 次数 吸光度 1 98.08 1 0.109 2 99.51 2 0.125 3