03第三章细胞生物学研究方法2013

1、2021-6-91 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 第二节第二节 细胞细胞及其组分的分析方法及其组分的分析方法 第三节第三节 细胞培养与细胞工程细胞培养与细胞工程 第四节第四节 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化 第五节第五节 模式生物与功能基因组的研究模式生物与功能基因组的研究 2021-6-92 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 工欲善其事，必先利其器。显微镜之 于生物学，犹如望远镜之于天文学。 2021-6-93 1.1 光学显微镜 提高分辨率的手段有缩短光线 波长

2、，应用特殊的光学效应， 增强反差。 最短的可见光波长是450nm， 此时分辨率约为0.3um，若在油 镜下，N可提高到1.5，分辨率 可达到0.2um。这个数值就是显 微水平和亚显微水平的分界线。 两束光波之间的相互干涉 2021-6-94 2021-6-95 不同显微镜下观察体外培养的成纤维细胞 A、普通光学显微镜 B、相差显微镜 C、微分干涉显微镜 增强样品的反差，实现了对非染色活细胞的观察 2021-6-96 荧光显微镜技术 细胞中有些物质，如叶绿素 等，受紫外线照射后可发荧 光；另有一些物质本身虽不 能发荧光，但如果用荧光染 料或荧光抗体染色后，经紫 外线照射亦可发荧光，荧光 显微镜就

3、是对这类物质进行 定性和定量研究的工具之一。 目前，荧光显微镜得到了广 泛的应用，特别是细胞内动 态的研究。 2021-6-97 荧光蛋白 日本科学家下村修、美国科学家马丁沙尔菲和美籍华裔 科学家钱永健获得2008年诺贝尔化学奖。 下村修是首位从水母中分离绿色荧光蛋白的科学家，他 发现这种蛋白在紫外线光中呈现亮色。马丁-查尔菲展示了绿 色荧光蛋白作为各种生物现象的亮光基因标签的价值。钱永 健对我们理解绿色荧光蛋白如何发光作出了贡献，他还将颜 色标签扩展至除绿色之外的颜色，以便可以用各种颜色标识 不同的蛋白和细胞。 2021-6-98 1.2 电子显微镜 电镜采用波长比可见光短得多的电子束作 为

4、光源。 电子束的波长只有0.01-0.9nm，分辨率可 达0.2nm，是光镜的1000倍。 电镜和光镜在基本原理上完全不同，但光 路图十分相近。 染色方法不同，光镜用染料，而电镜用重 金属盐，所以电镜不能观察活的细胞结构。 缺点：不能观察活的生物样品 2021-6-99 2021-6-910 电镜与光镜比较电镜与光镜比较 显微镜分辨本 领 光源透镜真空成像原理 LM TEM 200nm 0.2nm 可见光 （400- 700） 电子束 （0.01- 0.9） 玻璃透镜 电磁透镜 不要求真空 要求真空 1.33x10-5 1.33x10- 3Pa 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化 利用

5、样品对电子的散射 和透射形成明暗反差， 图像需要用荧光屏显示 或者感光胶片作记录。 2021-6-911 电镜超薄样本制备示意图 冷冻蚀刻技术 冷冻断裂 和蚀刻复 型 不需要包 埋和固定 2021-6-912 扫描电镜技术 电子探针激发样品表面（喷镀金膜）放出 二次电子，转变成光信号，得到样品表面 的立体图像信息。 2021-6-913 2021-6-914 高尔基体透射电镜图（伪彩色） 既然有了电子显微镜，还需要光学显微镜吗？ 2021-6-915 1.3 扫描隧道显微镜 根据隧道效应而设计， 是一种探测微观世界物 质表面形貌的仪器。分 辨率能达到0.1nm(原 子尺度)，非破坏性测 量，纳

6、米生物学。 1986年诺贝尔物理学 奖 类似的还有原子力显微 镜 小结 光镜、分辨率 光镜的发展：相差显微镜、荧光显微镜荧光显微镜 电镜电镜：原理原理、制片、扫描电镜、冷冻蚀刻 技术 扫描隧道显微镜 2021-6-916 单词 electron microscope, fluorescence microscope. 2021-6-917 2021-6-918 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 第二节第二节 细胞细胞及其及其组分的分析方法组分的分析方法 第三节第三节 细胞培养细胞培养与与细胞工程细胞工程 第四节第四节

7、 细胞及生物大分子的动态变化细胞及生物大分子的动态变化 第第五五节节 模式生物模式生物与功能基因组的研究与功能基因组的研究 2021-6-919 细胞组分的分离 差速离心：在密度均一的介质中由 低速到高速逐级离心，用于分离不同大 小的细胞和细胞器 2021-6-920 密度梯度离心 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度， 将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力 场的作用使细胞分层、分离。 2021-6-921 细胞内核酸、蛋白质、糖和脂类的 显示方法 原理：原理：利用一些显色剂与所检测物质中一 些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细 胞中的定位及颜色的深浅来判断某

8、种物质在细胞 中的分布和含量。 2021-6-922 1. 金属沉淀法：利用金属化合物在 反应过程中生成有色沉淀 2. 偶氮偶联法：酚类化合物与偶氮 染料结合后可以形成耐晒染料。 3. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff 试剂中的无色品红变为红色。通常用于显示 糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 4. 联苯胺反应 5. 普鲁士蓝反应：三价铁与酸性亚 铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。 6. Formazane反应：显示脱氢酶。 7. “Nadi”反应：显示细胞色素氧 化酶。 8. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂 类而使脂类显色。 9. 茚三酮反应：显示蛋白质。 2021-6-923

9、特异蛋白和特异核酸的定性和定位 特异蛋白抗原的定位与定特异蛋白抗原的定位与定 性性 主要是主要是免疫反应免疫反应 特异核酸的定位与定性特异核酸的定位与定性 分子杂交技术分子杂交技术 荧光显微镜荧光显微镜 电子显微镜电子显微镜 2021-6-924 利用免疫反应对特异蛋白抗原的定利用免疫反应对特异蛋白抗原的定 位与定性位与定性 免疫电镜技术免疫电镜技术 免疫荧光技术免疫荧光技术 2021-6-925 放射自显影技术研究生物大分子的 合成动态 原理及应用原理及应用： 利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含卤化银）的感光作 用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究； 特征是可以实现对细胞内生物

10、大分子进行动态和追踪研究。 操作操作： 见书P68和图3-22 2021-6-926 定量细胞化学分析技术 流式细胞仪 2021-6-927 显微光谱分析技术 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱， 核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有 自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸 收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。 有的成分经组织化学染色后，对可见光有 特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的 这种特性，可利用显微分光光度计对某些 成分进行定位、定性，甚至定量测定。 2021-6-928 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察

11、方法 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节第四节 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生物 2021-6-929 植物细胞和动物细胞的培养 动物细胞培养动物细胞培养 类型：类型：原代培养细胞（primary culture cell） 传代培养细胞（sub-culture cell） 细胞系细胞系（cell line） 永生细胞系，如Hela细胞系 植物细胞植物细胞 原生质体培养 （体细胞培养） 类型类型： 单倍体细胞培养（花药培养） 非细胞体系非细胞体系（cell-free system） 2021-6-930 细胞工程 细胞融合细胞融合与细胞杂交技术与细胞杂交技术 单克隆抗体技术（单克隆抗体技术（19841984年诺贝尔奖）年诺贝尔奖） 细胞拆合细胞拆合与显微操作技术与显微操作技术 2021-6-931 显微操作 2021-6-932 第三章第三章 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法 第一节第一节 细胞形态结构的观察方法细胞形态结构的观察方法 第二节第二节 细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法 第三节第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节第四节 用于细胞生物学研究的模式生物用于细胞生物学研究的模式生