基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究

1、基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究摘要RNA干扰作为一种治疗途径尤其是恶性肿瘤的治疗具有巨大潜力。然而，系统递送siRNA需要高效和生物相容性的递送手段。肿瘤细胞通过过度表达清道夫 B型1受体类（SR-B1）受体以清除HDL（HDL）粒子来维持其高生长水平。本文利用 这种细胞特性来实现高效siRNA递送，通过siRNA偶联重组成HDL（rHDL）纳米粒 子建立一种新型的siRNA制剂。这里,我们证实rHDL纳米粒子促进了 siRNA体内 高效递送。此外，概念证明治疗研究中，这些纳米粒可以有效沉默两种蛋白的表 达，在原位卵巢和结肠直肠

2、癌小鼠模型中， 这两种蛋白是癌症生长和转移的关键 （信号传感器和转录激活因子3以及粘着斑激酶）。这些数据表明，rHDL纳米粒是 一种新型、高效的siRNA载体，因此。这种新型技术可以作为新型癌症治疗方法 的基础。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖。介绍RNA干扰（RNAi ）逐渐被认为是一种潜在，高效的治疗途径。这个概念根 源于干扰RNA （例如，小分子干扰RNA ）基因沉默的能力，传统治疗方法很难 靶向这些基因，如抗体或小分子抑制剂。即使干扰RNA靶向特定基因确实很有前景的，但需要体内高效和生物相容性的siRNA递送手段来实现其完整的治疗潜 力。虽然一些使用脂质体或其它纳米粒子的跨膜转运方法也已经报道，但

3、是因毒性和其他因素其治疗应用受到限制。 因此，需要新型，更具有特定性的方法以系 统递送siRNA。聞創沟燴鐺險爱氇谴净。脂蛋白，尤其是HDL，是脂质运输系统的必要成分。HDL在胆固醇逆转中起着举足轻重的作用，通过促进外周细胞多余胆固醇返回到肝脏进行消除（胆汁排泄或在肝肠循环使用）。关于内源性，HDL纳米粒是完全可生物降解的，并 且也无引起免疫反应的相关报道。 此外，众所周知，HDL纳米粒可以逃避网状内 皮系统的吸收，比大多数药物制剂或其他脂蛋白，他们在循环中表现出更长的滞留时间。HDL纳米粒循环的核心部分就是摄取，通过清道夫受体B类1型（SR-B1 ）受体介导的机制，这种受体主要表达在肝脏和恶

4、性肿瘤细胞。基于 体积小，屏蔽疏水核心，受体介导的摄取能力等这些有效特征，HDL纳米粒是一 种理想的药物载体。重组HDL是由人的HDL合成得到的。该rHDL纳米粒的组成 部分有磷脂酰胆碱，载脂蛋白A -1，胆固醇和胆甾醇酯（图1A）0 rHDL纳米粒 都很小，直径约12至18纳米。残骛楼諍锩瀨濟溆塹籟。为了研究siRNA靶向输送途径，一些肿瘤细胞受体已被获知。SR- B1受体主 要在肝脏中的表达，也在肾上腺或正常卵巢组织也较小程度表达。然而，在恶性肿瘤细胞中SR - B1非常显著表达。增加HDL摄取可使肿瘤细胞产生较高增殖率。 例如，乳腺癌细胞通过增加SR- B1的表达来增加胆固醇酯的摄取。因

5、此，考虑到 SR- B1在HDL中的作用，我们认为rHDL纳米粒可以作为选择性输送的有效载体。 酽锕极額閉镇桧猪訣锥。siRNA基因沉默治疗非常有效，其他方法很难靶向这些基因。信号传感器和 转录激活因子3 STAT3 都可以介导正常细胞对多种细胞因子和生长因子的反 应。激活STAT3是恶性肿瘤转化和发展（例如，细胞增殖，分化和存活）的关 键过程。虽然STAT3可以在许多实体瘤里激活，但是它在正常组织中表达，并且 参与许多正常细胞过程。因此，使用小分子抑制剂或其他非特异性靶向STAT3的手段可能会导致许多不必要的副作用，因此需要有效途径限制毒性。同样，粘着 斑激酶（FAK）对于肿瘤细胞存活，转移

6、，入侵也非常重要。在卵巢癌患者中， FAK过度表达与侵袭性肿瘤的特征相关，这有助于弱势细胞生存。概念证明，我 们在卵巢癌和大肠癌模型中证实使用 r HDL纳米粒靶向STAT3和 FAK治疗有效 性0彈贸摄尔霁毙攬砖卤庑。原料与方法rHDL纳米粒的制备和siRNA的偶联siRNA偶联到rHDL纳米粒，并储存在-20 C。简单地说，载脂蛋白A-I ， 是rHDL纳米粒的主要核蛋白，在生产蛋白过程中用质粒载体进行分离和纯化。 然后，脂类混合物（胆固醇C /胆固醇油酸CE /蛋黄卵磷脂PC，摩尔比的 1:5:1.3:115）在氮气流中干燥。5mg的siRNA用25卩g低聚赖氨酸（平均分子量 为500-

7、2000 ）在300预先孵育30分钟，然后加入到脂质成分中。 低聚赖氨酸/ siRNA混合物偶联脂质，分散在60卩I的DMSO和1.4ml的缓冲液（10mM Tris, 0.1M KCl , 1mM pH 为8.0的 EDTA）。胆酸钠，140 卩 L （ 100mg/ml 溶于为 PBS ）形成的蛋黄卵磷脂摩和胆酸的摩尔比为1:1.6。载脂蛋白A-1（ 12.7mg/ml） 溶于0.4mlPBS加入到混合物中，终体积用 PBS调整到2ml。4 C孵育12h,接 着用2L的PBS透析2天，换3次透析缓冲液。制剂的稳定性凝胶排阻色谱中用的RiboGreen检测。rHDL/靶向siRNA溶液用0.

8、9 %的生理盐水稀释到为 0.2mg/Kg的siRNA/0.2ml rHDL的溶液。此外，rHDL纳米粒子的Z电位使用电 位粒度分析仪检测。简单地说，1ml的纳米粒加入1ml的比色皿中作zeta电势 检测。謀养抟箧飆鐸怼类蒋薔。透射电子显微镜法在0.125M乙酸铵，2.6 mM的碳酸铵，0.26 mM的EDTA，pH值7.4中透 析后，rHDL样品用pH值7.2的2%磷钨酸钠并放在福尔瓦/200目镍网支持膜包 裹的碳涂层进行负染。颗粒明显可见（放大50000咅），通过使用Zeiss 910透射 型电子显微镜。得到的图片有所增强，粒径可通过Adobe lmageCS2软件检测。厦礴恳蹒骈時盡继價

9、骚。细胞系和培养条件衍生和源于人体上皮卵巢癌细胞系的HeyA8， SKOV3ip1，HeyA8 -MDR细胞系在之前已有研究。人类大肠癌细胞株 （HCT116）对于Dr Lee Ellis。本篇文 章中所用到所有细胞株都是德克萨斯大学MD安德森癌症中心的，通过表征细胞线芯的研究得到认证。简单地说,HeyA8和SKOV3ip1细胞在添加15%胎牛血清 和0.1%硫酸庆大霉素的 RPMI1640培养基中培养。HeyA8-MDR细胞在添加有 15%的FBS和300 ng / ml紫杉醇以及0.1%硫酸庆大霉素的RPMI 1640培养基培 养。HCT116细胞在添加10%的FBS和0.1%硫酸庆大霉素

10、的改良伊格尔培养基中 培养。所有的细胞都保存在37 C，5% CO2/95%的孵箱中。茕桢广鳓鯡选块网羈泪。体外基因沉默STAT3 （靶序列 5 - GCCUCUCUGCA GAAUUCAA -3），粘着斑激酶（靶 序列5CCACCUGGGCCAGUAUUAU -3），和一个非定标性的控制序列（靶序 列的 5 - UUCUCCGAACGUGUCACGU -3）均购自 Sigma-Aldrich 公司， RNAiFect转染试剂按照厂家建议使用。简单地说，SK0V3ip1和HeyA8 - MDR卵巢癌细胞系在一式三份的六孔板用1.33卩g特定siRNA/孔进行转染，在70 % 处汇合。分别使用1

11、:3.75的siRNA和转染试剂进行转染，对照 siRNA和STAT3 siRNA组无血清培养基培养6 ho鹅娅尽損鹤惨歷茏鴛賴。RNA提取和互补DNA的制备细胞使用Trizol而均化。RNA通过提取（氯仿）,沉淀（异丙醇）和纯化（75%乙醇）。 cDNA通过使用SuperScript-ll逆转录酶得到2.0卩g高质量的RNA 籟丛妈羥为贍 债蛏练淨。微序列分析在SKOV3细胞使用Illumina平台得到cDNA微序列。根据厂家的建议使用 RNAiFect转染试剂，该细胞置于一式三份含 STAT3（8.0卩g）或对照siRNA（8.0卩g） 的10厘米细胞培养板。在微序列分析前，STAT3基因

12、沉默利用蛋白质印迹在蛋白 质水平得到证实。从微序列分析得到的基因表达数据，加载到异丙醇独创性通路 数据库，关于凋亡基因的不同表达可以验证选择性。預頌圣鉉儐歲龈讶骅籴。聚合酶链反应分析反转录聚合酶连锁反应（RT-PCR）可以利用cDNA预先形成正常人体器官和 癌症细胞系。人类肝中的cDNA利用SR-B1表达作为阳性对照组。RT-PCR在应 用生物系统公司9500系列中完成，使用条件为之前已作介绍。肌动蛋白作为一个 内源性对照。平均改变倍数已经报道。渗釤呛俨匀谔鱉调硯錦。蛋白质印迹分析用改良放射免疫沉淀裂解缓冲液制备细胞裂解液。在 8 % SDS-PAGE中分离 蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜，随后

13、与STAT3 ( 1:2500 )或FAK (1:5000 ) 抗体在4 C孵育过夜。主要抗体通过抗鼠免疫球蛋白 G和化学发光检测试剂 盒检测。肌动蛋白或黏着斑蛋白证实相同的负载量 。铙誅卧泻噦圣骋贶頂廡。卵巢癌细胞细胞凋亡分析对照或STAT3 siRNA 处理后24小时后，卵巢癌细胞(SKOV3ip1和 HeyA8-MDR)细胞用多烯紫杉醇(分别为1或500nM)处理72小时，水洗，并用5 卩l膜联蛋白V / PE和7AAD抗体孵育30分钟。流式细胞仪分析之前的样品。擁 締凤袜备訊顎轮烂蔷。免疫组织化学新鲜冷冻部分由CD31染色(1:800稀释)，ki - 67染色是在5卩m厚的福尔马林 固

14、定石蜡包埋标本上。为了定量微血管密度，细胞增殖指数(ki - 67)和半胱氨酸蛋白酶-3清除率，5个随机区域每个肿瘤放大100咅进行研究。在人类上皮卵巢肿 瘤(n = 50)在 SB-R1的表达可以用福尔马林固定石蜡包埋标本检测，这种方法源 于德克萨斯大学MD安德森癌症中心，是经过机构审查委员会批准。高表达或低 表达都是由妇科病理学家使用下列程序来决定的：强度从1到3,分布是从1到4。贓 熱俣阃歲匱阊邺镓騷。TUNEL染色取新鲜冷冻的实验组(SKOV3ip1模型)肿瘤组织部分，通过末端脱氧核苷酸转移 酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口尾部标记进行末端染色，再用1:10,000的Hoechst进行复染。

15、凋亡小体通过绿色荧光表示。Tunel阳性细胞在10个200X区域，每组 分为5个部分进行计数，得到平均值。 坛搏乡囂忏蒌鍥铃氈淚。siRNA选择性递送SK0V3ip1雌性裸鼠用0.2mg/Kg的荧光标记对照siRNA或无标记对照siRNA （每组n = 3时）静脉注射或腹腔注射。48小时后，处死小鼠，收集肿瘤和器 官（脑，心脏，肺，肝，肾，脾）并冷冻。蜡變黲癟報伥铉锚鈰赘。荧光染色取新鲜冰冻得原位卵巢癌模型（SK0V3ip1 ）的肿瘤组织，置于丙酮中， 用PBS洗涤，并用Hoechst （1:10,000 ）复染。荧光显微镜在400 X的视野来 分析幻灯片。每张幻灯片有十个高倍区域，取平均值。

16、原位卵巢癌模型雌性裸鼠（10? 12周龄）购自美国美国国家癌症研究所。所有的实验都是由MD安德森癌症中心机构动物护理和使用委员会批准。買鯛鴯譖昙膚遙闫撷凄。体内FAK靶向对于FAK靶向实验（SKOV3ip1模型），治疗组分为（每组n=10）: 1）空 rHDL 纳米粒，2）对照 siRNA / rHDL，3） FAK siRNA / rHDL，4）对照 siRNA + 多烯紫杉醇，5） FAK siRNA / rHDL+多烯紫杉醇綾镝鯛駕櫬鹕踪韦辚糴。体内STAT3靶向STAT3基因沉默实验，根据以下各组（每组n=10）进行试验：1 ）对照siRNA / rHDL， 2 ）对照 siRNA /

17、 rHDL+ 多烯紫杉醇，3 ） STAT3 siRNA / rHDL，4 ） STAT3 siRNA / rHDL+多烯紫杉醇。适合的肿瘤细胞来源于卵巢癌小鼠模型（HeyA8，SKOV3ip1和HeyA8 MDR ）用腹腔注射接种。小鼠随机饲养并在第 7天后开始处理。约HeyA8模型3周后或SKOV3ip1和HEYA8 - MDR 5周后，解 咅y小鼠，收集肿瘤。驅踬髏彦浃绥譎饴憂锦。大肠癌转移模型对于大肠癌转移模型，HCT116细胞注入雌性裸鼠脾脏（治疗组 N = 10 ）。 两个星期后，按照前面描述的开始用奥沙利铂处理，根据图 2C所示。4周后，解 剖小鼠，收集肿瘤猫虿驢绘燈鮒诛髅貺庑。

18、体内沉默STAT3或 FAK基因的有效剂量通过在 SK0V3ip1模型小 鼠注入剂量范围为 0.1? 0.2mg/KgSTAT3 siRNA / rHDL 或 FAK siRNA / rHDL 来 测定。小鼠在第2, 4或6天解剖。收集肿瘤组织，采用蛋白质印迹分析蛋白表达 锹籁饗迳琐筆襖鸥娅薔。统计分析如果呈正态分布连续变量可以使用t检验（在两个组）或方差分析（所有组）进行比较。在非参数值中，连续变量使用曼-怀氏等级和检验或秩和检验（所有组）进 行比较。rHDL体内研究将治疗组每10只小鼠被随机分配。我们使用SPSS和GraphPadPrism软件对所有结果进行处。我们认为 P .t5ad 也

19、5呻闻Mwll 嗔家T p0.00l compared to untaged siRNA/rHDL(B)STAT3 siR NA/rH DL+docetaxel Control &IRNA/rHDLi-doc&tax&l STATJsiRNWrHDL Control siRNWrHDLSKOV3ip1 * HeyAB-MDRlumor 她ight (g)(C)STAT3 siRNA/rHDL+oxaliplatinl 卄HCT 116STAT3 siRNA/rHDLControl siRNA/rHDL+oxaliptinW Control siRNA/rHDL 0 12 *FAK siRNA/

20、rHDL+doctaxetk * SKOV3ip1HCT 11&Tumor weight (g)Tumor nodules (number)Figure 2.Systemic delivery of siRNA using rHDL nan oparticles. (A) Uptake of Alexa555-labeled siRNA/rHDL in SKOV3ip1 tumors. A single IV or IP injection of 0.2 mg/kg of Alexa555 labeled or 0.2 mg/kg of IV and IP injectio n of un t

21、agged siRNA/rHDL was admi nistered in mice beari ng SKOV3ip1 tumors, and 48 hours later, tumors were harvested and coun tersta ined with Hoechst(blue), and siRNA (red) uptake was assessed with fluoresce nee microscopy. The H&E imageshows tumor histologic diag no sis. The adjace nt graph shows perce

22、nt Alexa555-positive cells.(B)ln vivo efficacy of STAT3 siRNA/rHDL in chemose nsitive (HeyA8 and SKOV3ip1) andchemoresista nt (HeyA8-MDR) mouse models of ovaria n carci no ma. *P .05 compared withcon trols. *P .05 compared with con trols as well as docetaxel alone. (C)I n vivo efficacy ofSTAT3 siRNA

23、/rHDL in colorectal ca ncer model of liver metastases (HCT116). *P .05 comparedwith control siRNA/rHDL, *P .05 compared with STAT3 or oxaliplatin alo ne.ln vivoefficacy ofFAK siRNA/rHDL in the SKOV3ip1 ovarian cancer model.*P .05 compared with con trols. *P .05 compared with con trols as well as doc

24、etaxel alo ne. Error bars, SEM 鯊腎鑰诎漣鉀沩懼統庫。STAT3或FAK基因沉默对肿瘤的生长和转移的影响体内成功沉默FAK或STAT3基因后（图W3B），我们接下来测试了这种是否 用多烯紫杉醇化疗药方法的治疗有效性。我们首先用STAT3 siRNA / rHDL靶向STAT3（图2 B）。在三个原位卵巢癌小鼠模型中用单独 STAT3 siRNA / rHDL或偶 联多烯紫杉醇进行治疗。在HeyA8模型中，单独给STAT3 siRNA / rHDL或多烯 紫杉醇减少了的62%的肿瘤重量（P 0.5年，两者）。与对照组比较，STAT3 siRNA / rHDL和多烯紫

25、杉醇的联合治疗使肿瘤重量减少的最多（92%，P 0.05）。在SKOV3ip1模型中结果类似（图2 B）。另外，当STAT3 siRNA / rHDL有无多烯紫杉 醇处理小鼠，HeyA8和SKOV3ip1卵巢癌模型中证实了肿瘤结数量的剧减。（图 W4A）硕癘鄴颃诌攆檸攜驤蔹。考虑到STAT3的耐药性，我们还进行了紫杉醇耐药HeyA8-MDR模型实验（图 2 B）。正如预期，多烯紫杉醇对肿瘤的生长无显著影响。STAT3 siRNA / rHDL单 药疗法使肿瘤生长减少了 76%（P0.01）。多烯紫杉醇和STAT3 siRNA / rHDL联合 疗法使肿瘤细胞的增长减低的更多（比起对照组，91%

26、，P 0.001;比起多烯紫杉 醇，89%，P 0.1）。肿瘤节数量也有类似的效果（图2）。我们在每一个治疗组的 动物的局部转移频率进行了分析。相比于对照组和多烯紫杉醇单药疗法，STAT3siRNA / rHDL是否偶联多烯紫杉醇都能显著降低上腹部和薄壁肝组织的转移。阌擻輳嬪諫迁择植秘騖。接下来，我们研究在转移性结直肠癌小鼠模型（HCT116 ）研究STAT3沉默基因的治疗效果，该模型使SR -B1表达（图2C）。肿瘤细胞注射到脾脏后，转 移扩散到肝脏。STAT3 siRNA / rHDL单独治疗导致在肿瘤的重量减少79% （ P 0.01）。对于这些实验，我们常用细胞毒性，奥沙利铂，偶联ST

27、AT3 siRNA /rHDL。奥沙利铂降低55 %的肿瘤生长（P 0.01 ）。与对照组相比，奥沙利铂 和STAT3 siRNA / rHDL偶联治疗可使肿瘤重量（96 %，P 0.01 ）和肝脏中转 移损坏数目（86%，P 0.01 ）显着减少。为了评估rHDL纳米粒的安全性， 我们评估用rHDL纳米粒处理小鼠的几个参数（图 W5 ）。在两个不同治疗组 中，动物体重或肝功能测试（AST和ALT比值）没有显着差异（图 W5，A 和B）0与对照组相比，治疗结果显示没有显着变化后，多个正常器官用苏木精 和伊红（H & E ）染色（图 W5C ）氬嚕躑竄贸恳彈濾颔澩。为了测试rHDL纳米粒对其他靶

28、点的效用潜力，我们进行了 FAK siRNA / rHDL实验。我们在SK0V3ip1原位卵巢癌模型中用FAK siRNA / rHDL纳米粒 靶向FAK（图2 C）o FAK或多烯紫杉醇单药治疗可使肿瘤重量减少 62%和74%（两 者P 0.01）o联合治疗显著减少肿瘤重量（96%, P 0.01）,肿瘤节的数量（74%, P 0.05）。空rHDL纳米粒和对照siRNA / rHDL处理的小鼠之间没有显著差异。釷 鹆資贏車贖孙滅獅赘。STAT3靶向肿瘤微环境的影响为了了解STAT3 / rHDL的生物效应，在药物敏感的（SKOV3ip1）和药物耐药 （HeyA8-MDR）卵巢癌模型中进行一

29、系列的体内体外实验。在SKOV3ip1卵巢癌模 型中（图3）, STAT3基因沉默减少26%细胞增殖（P 0.05），而多烯紫杉醇抑制30% 肿瘤细胞增殖（P 0.05）。与对照组比较，STAT3 siRNA / rHDL和多烯紫杉醇联 合治疗可抑制48%肿瘤细胞增殖（P 0.05）（图3）。在HeyA8-MDR卵巢癌模型中（图 W6），就多烯紫杉醇处理对于细胞增殖就没有效果，STAT3siRNA / rHDL单药可减少19%田胞增殖。对照组比较，STAT3 siRNA / rHDL和多烯紫杉醇偶联治疗可 显著降低细胞增殖（39%，P 0.05） o怂阐譜鯪迳導嘯畫長凉。为了确定STAT沉默对

30、肿瘤相关血管生成的影响,我们从所有四个实验组取 新鲜冷冻肿瘤组织的样品进行 CD3染色实验（图3和W5和检测MVD在SKOV3ip1 模型,STAT3 siRNA / rHDL或多烯紫杉醇单药治疗在 MVD图3）产生66%i69%勺降 低（P 0.05）。比起对照组，STAT3 siRNA / rHDL和多烯紫杉醇偶联治疗在 MVD 可减少88%（P 0.05） o同样，在HeyA8-MD模型中，就多烯紫杉醇处理对 MVD的 降低没有影响，但多烯紫杉醇和 STAT3 siRNA / rHDL偶联治疗可显著降低（图 W6）b谚辞調担鈧谄动禪泻類。众所周知，STAT3被认为是增加细胞存活和抑制细胞

31、凋亡。因此，我们在SKOV3ip1卵巢癌模型中用TUNEL染色法（图3）,在HeyA8-MDR模型活化型半胱天冬酶染色法（图W6）研究了肿瘤细胞的凋亡效果。在 SKOV3ip1模型，与对 照组比较，STAT3基因沉默或多烯紫杉醇治疗可增加8-12倍的细胞凋亡（P 0.05）。与对照组（P 0.05）相比，STAT3 siRNA / rHDL和多烯紫杉醇的联合治疗可增加30倍的肿瘤细胞凋亡。除此之外，在HeyA8-MDR模型中，就多烯紫杉醇处理不影响细胞凋亡，对照组 siRNA / rHDL 相比，STAT3 siRNA / rHDL 或 STAT3 siRNA / rHDL与多烯紫杉醇联合治疗

32、可大幅增加（分别为61%和76%,两者P 0.05）凋亡 细胞（阳性活化型半胱天冬酶-3 ）（图W6）嘰觐詿缧铴嗫偽純铪锩。sQUCqi-Ifq s RNA-rHDLSTAT3siRNA-iFI0L+doceraxellControl siRNA-rHDL5W3 siRNA-rHDL +ducelaxelID*p0.03 compared to control siRNArHDL ip 0.0Sio control and cooiparelto either treatment alone5Figure 3.Effect of rHDL-incorporated STA T3 siRNA o

33、n tumor microenvironment. Tissues harvested after STAT3 siRNA/rHDL therapy were subjected to immun ohistochemistry for markers of proliferation (Ki-67), angiogenesis (CD 31), and apoptosis (TUNEL). For the TUNEL stain, five ran dom fields per slide were exam ined with fluoresce nee microscopy, and t

34、he nu mber of apoptotic bodies and nuclei is reported as average percent apoptotic cells (200 x ). Error bars, SEM.熒绐譏钲鏌觶鷹緇機库。卵巢癌细胞的STAT3沉默的组织标记基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究为了识别潜在组织标记对 STAT3基因沉默的响应，我们在卵巢癌细胞对对照 和STAT3 siRNA进行基因组分析（图4, A和B）。这两组间有460个基因表达差异。 生物数据指出，STAT3沉默后凋亡和修复是细胞生存的主要影响，我们重点研究 这些途径的基因（表 W

35、1）。从表中知，我们使用 RT-PCR验证STAT3基因沉默后 最显著改变的12个基因（图4 C）。STAT3基因沉默的程度与两个模型保持一致。 STAT3基因沉默大量减少了关键生存基因， 这些基因主要用来调节 MAP激酶和 AKT通路（图4）。这些基因可以作为响应靶向 STAT3疗法的重要组织标记基因。 在HeyA8-MDR模型中也有类似的结果（数据未显示）。鶼渍螻偉阅劍鲰腎邏蘞。Fold change4-2024(B)Control sl-iControl si-irControl wi-iiiSTATJsi4STAT3 si-iiSTAT3 si-iiiUp-regulated Down

36、-regulated) abuEcQ30CMicroarray qRT-PCRFigure 4.Effect of STAT3 sile ncing on gene expressi on profile of ovaria n can cer cells. (A) STA T3rsiRNA (in vitro), microarray an alysis was performed. Heat map (A) represe nts the over all genesile ncing modulates gene expressi on of apoptosis related gen

37、es. After STAT3 sile ncing with基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究expressi on cha nges. An alysis of apoptosis-related (B) genes are show n. (C) Validati on ofmicroarray. Apoptosis-related genes that were differe ntially expressed betwee n con trol siRNA andSTAT3 siRNA treatme nt groups were validated with qua

38、 ntitative real-time RT-PCR. Average foldcha nge is prese nted. Error bars, SEM .纣忧蔣氳頑莶驅藥悯骛。体外STAT3沉默对细胞凋亡的影响为了确定 STAT3基因沉默是否直接影响肿瘤细胞的凋亡，在卵巢癌细胞 (SKOV3ip1和HeyA8-MDR)的模型中，我们检测 STAT3 siRNA是否含有多烯紫 杉醇对细胞存活的影响(图5)。STAT3沉默用免疫印迹分析证实(图W3A)。在 SKOV3ip1细胞,STAT3 siRNA或多烯紫杉醇单药治疗增加凋亡 (分别是3和5.2 倍，两者P 0.05),而对照组相比，联

39、合治疗增加7.7倍细胞凋亡(P 0.05)。与多 烯紫杉醇治疗相比，STAT3 siRNA可增高41%的细胞凋亡(P 0.05),这表明在体 内凋亡效应的确实受到直接影响(图5A)。此外，在HeyA8-MDR细胞多烯紫杉醇 治疗没有产生显著凋亡(图5 b)然而,STAT3沉默后增加多烯紫杉醇，比对照组相 比可增加175%(P 0.05)的细胞凋亡，与单独多烯紫杉醇治疗可增加 98%的细胞 凋亡(P 0. 05)o颖刍莖峽饽亿顿裊赔泷。(A)SKOV3ip1但300i4a20a】Figure 5.Effect of STAT3 sile ncing on apoptosis. STAT3 was

40、 sile need using STAT3-specificapoptosis was assessed using flow cytometry (annexin V). Average perce nt apoptosis (AnnexinV/PE -positive SKOV3 cells) and average percent apoptosis compared with control (annexinV/PE -positive HeyA8-MDR cells) are reported. Error bars, SEM 濫驂膽閉驟羥闈詔寢賻。讨论本研究的关键发现就是在体内r

41、HDL纳米粒能有效地传递siRNA以沉默基 因，这些基因对癌症的增长和发育很重要。这个概念建立在多个肿瘤模型中，通过siRNA包入rHDL纳米粒以介导的高效STAT3或 FAK基因沉默。生物效果是 通过降低肿瘤细胞增殖，减少降低血管生成，降低细胞生存率来评估。銚銻縵哜鳗鸿锓謎諏涼。尽管干扰RNA是一个高度特定基因沉默的模式，源于在体内全身输送的障 碍，目前其治疗应用受到限制。为了克服这些障碍，选择性生物相容性的运载系统是必要的。到目前为止，一些纳米粒系统已经具有潜在的治疗措施，然而，由于缺乏组织特异性和体内广泛分布大部分这些系统可能在对正常组织产生毒性。因此，非特异性递送系统可能需要更高的剂量

42、来达到有效性和持续的基因沉默。因 此，比起其他方法，靶向性递送系统克服这些障碍更理想。挤貼綬电麥结鈺贖哓类。递送siRNA的rHDL传输系统具有许多的优点。例如，rHDL核心成分的细 胞摄取通过一个特定的受体(SR-B1)完成。我们的数据表明，与正常组织相比， SR-B1受体在肿瘤细胞中的表达增加。这些表达差异可能有助于避免副作用。在 目前研究中，rHDL纳米粒的吸收主要局限于肿瘤和肝。这种吸收模式与SR-B1表达分布完全一致。此外，我们的安全研究表明，对照组siRNA相比，STAT3 /rHDL在小鼠肝脏中吸收没有任何不良反应。赔荊紳谘侖驟辽輩袜錈。概念验证，我们证实了多种临床前模型成功靶向

43、两个关于癌症生长和增殖重 要的基因。STAT3是一个良好的转录因子，涉及到肿瘤增殖和转移的许多关键过 程。干扰RNA是一种有效的治疗策略，尤其是对其他方法不易给药的靶点。即 使STAT3被广泛认为是一个重要的癌症启动子，传统治疗方法因其靶向性受到的 限制。因此，所说的siRNA递送系统对于靶向STAT3和恶性肿瘤增长促进剂是 很重要的途径。减少血管生成的生物效应， 继发于肿瘤细胞的STAT3沉默，这 点已经得到支持，是通过STAT3激活剂来调节血管内皮生长因子的表达。 在肿瘤 细胞中激活STAT3与血管内皮生长因子表达的增加是相关的。 所以，药理干预靶 向STAT3对于这里描述的纳米技术是可能

44、的。塤礙籟馐决穩賽釙冊庫。此外，其他实体瘤中，FAK在直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺、前列腺癌 上过度表达这一点也曾报道过。在卵巢癌患者中，FAK的过度表达与肿瘤相关功能在所有存活者中并不明显。用脂质体或小分子抑制剂系统性靶向FAK显示减少肿瘤生长和转移，但是，这种方法并非肿瘤特异性并且可能产生毒性。FAKsiRNA / rHDL治疗方法具有高度肿瘤特异性，可以显著抑制肿瘤的生长和转移 并且对其他器官无明显副作用。裊樣祕廬廂颤谚鍘芈蔺。总之，用rHDL纳米粒系统性递送siRNA为治疗人类恶性肿瘤开拓了新的视 野。这个递送方法不仅高效的，而且具有选择性和生物相容性。因此，rHDL纳米粒癌症管理中

45、具有显著的应用。仓嫗盤紲嘱珑詁鍬齊驚。SR-B1 ActinNormat organsSR-B1 ActinSR B1ActinBreast cancerColorectal cancerSR-B1ActinPancreatic cancerSR B1 ActinOvarian cancerFigure WI.Expressi on of SR-B1 mRNA in differe nt huma n orga ns and tumors using RT-PCR.Act in is used as a loadi ng con trol.绽萬璉轆娛閬蛏鬮绾瀧。=泄CQsIV-s iRNAf

46、lP*Al8xa555-s IRNW Unta 9 ed siRNA/H&ErMDLrHDLrHDLCTC3Figure W2.Distributi on of systemic delivery of fluoresce nt-labeled siRNA/rHDL.AIexa555-labeled control siRNA/rHDL or un tagged siRNA/rHDL was injected (IV or IP), and 48 hours later, organs were harvested. Fresh-frozen tissues were counterstain

47、ed with Hoechst, and the level of fluoresce nt-labeled siRNA (red) was assessed with fluoresce ntmicroscopy. Average fluoresce nee uptake is represe nted by the graphs. *P .05 compared withun tagged siRNA/rHDL. H&E represe nts the organ morphology骁顾燁鶚巯瀆蕪領鲡赙。基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究ItQO V uo-stnaJdM也

48、STAT3Actin一50o eQ-审喲勵dxft-曲1芒5FAKActino o no 51-豆C0IJ応总Figure W3.STAT3 and FAK sile ncing with siRNA/rHDL. (A) STAT3 siRNA treatme nt (in vitro)in SKOV3ip1 ovarian cancer cells. (B)STAT3 siRNA/rHDL. (C) FAK siRNA/rHDL was injected in mice beari ng SKOV3ip1 ovaria n tumors. Wester n blot an alysis de

49、m on strates relative protein expression. Graphs represent mean expression intensity measured with densitometry 瑣钋濺暧惲锟缟馭篩凉基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究Aa- HeyAB_. SKOV3ipi*p 0,05 compared to control siRNA/rHDLhey 倉 a 閘 drSTAT3 filRNAXrHDL + docttaxflSTAT3 siRNA/rDLCcnlrol siRNA/rtIDL + dccetaxelControl s

50、lRHA/nHDL碑-5證Animals with metastasisuuw-d 就h 亠 JlqJa.onffla-u工.ydp jO.q5 compared to control siRNArHDLcancer model鎦诗涇艳损楼紲鯗餳類。Figure W4.ln vivo effect of STAT3 siRNA/rHDL with and without docetaxel therapy on tumornodules in (A) HeyA8 and SKOV3 and (B) HeyA8-MDR ovarian cancer models. The averagenumb

51、er of tumor no dules is prese nted as a bar graph. Error bars, SEM. Three-dime nsional graphdepicts the distributi on of ovaria n tumor metastasis in HeyA8-MDR (Taxol-resista nt) ovaria n基于脂蛋白纳米载体的小干扰RNA靶向递送方法研究20104 2amEHAE).e西!匚 sSTAT3 SiRNAJrHDLControl tiRIMAfrHDLCOiilrO) iRNA/rHDL 电 tax 合 DSTAT3