冰冻切片的免疫荧光

1、中山大学附属第一医院肾内科实验室 免疫荧光通用操作规程 冰冻切片的免疫荧光 1, 动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4C过夜 后，OCT包埋。-20C保存3月，-80C长期保存。请勿保存于液氮。 2, 冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后，-20C储存 3, 切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA 固定15分钟，或-20 C丙酮固定15分钟置通风橱2小时 4, 1XPBS清洗玻片，3X5min从此请保持玻片湿润 5, 有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请：选用稳定的 抗原修复方式（真空负压微波修复高压修复隔水加热电炉加热） 关注修复

2、的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的 时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液 选择不同PH值的修复液（A液 枸盐酸缓冲液 PH6.0, B液 EDTA-Na缓冲液PH8.0,C液枸盐酸缓冲液PH4.5） 6, 室温圭寸闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细 胞因子，无需圭封闭的蛋白 7, 一抗4C过夜 请用圭寸闭液稀释一抗 8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （dyeligh

3、t ）in 封闭液，避光室 温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5mi n 11, DAPI 染核 5min , 12, DDW Rinse 13, 抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14, 干片后4C保存 石蜡切片的免疫荧光 1, 动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤），制成石蜡 包块 2, 组织学染色切片厚度 2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um, 切片复水： 58 C 20mi n- xyle ne 2x10mi n- 100%EtoH2x10mi n 95%EtoH2x10mi n- 70%EtoH10mi n-, DDW5mi n 4, Rinse

4、玻片IxPBS,从此请保持玻片湿润 5, 抗原修复过夜。为此请： 选用稳定的抗原修复方式 （真空负压. 微波修复高压修复隔水加热电炉加热）关注修复的温度，时间 （抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须 遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液 选择不同PH值的修复 液（A液枸盐酸缓冲液 PH6.0, B液EDTA-Na缓冲液PH8.0, C液 枸盐酸缓冲液PH4.5） 6, 室温圭寸闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in IxPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS （细 胞因子，无需圭封闭的蛋白 7, 一抗4C过夜

5、 请用封闭液稀释一抗，如果没有二抗种属来源的正常血清，细胞 因子用1%BSA封闭，同时一定要有一个阴性对照。 8, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 9, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （ Dyelight ）in 封闭液，避光室 温1小时 10, Wash,1XPBS, 3x5mi n 11, DDW Rinse , DAPI 染核 5min, 12, DDW Rinse 13, 抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜 14, 干片后4C保存 备注: 多重荧光染色原则 A:尽量选择不同种属来源的一抗：可同时染 B:如果种属来源相同的一抗：可顺次染色，

6、抗原修复：0/N 第一个一抗：4C O/N ,第二天对应二抗 RT 1hr红光 短暂地封闭 第二个一抗：RT 2hr,对应二抗RT 1hr绿光 DAPI 封片 备注：对照实验 A:阴性对照：组织免疫荧光必做 相同标本：只加荧光二抗：排除非特异性染色 不同样本：采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性 B :阳性对照：采用确定含有一抗对应抗原的标本 TUNEL与免疫荧光共染时 细胞的免疫荧光 1, 细胞生长贴壁到80%融合，倒掉细胞培养液 2, Rinse,用固定剂rinse 到两次 3, 首选 4%多聚甲醛固定 15min , 0.2%TritonX-100 打孔 5-10min;

7、或者选用不同的固定方式： 甲醇（分析纯 or HPLC）-20C 10min 丙酮（HPLC）-20 C 10min 4%多聚甲醛 +0.2%TritonX-100 10min 4%多聚甲醛+0.2%Sap onin slOmin细胞核核膜 4%多聚甲醛15min + -20C甲醇5min细胞膜 4%多聚甲醛15min + -20C丙酮5min细胞骨架/微管蛋白 4%多聚甲醛10min RT+4 C 10min+ -20C甲醇1min细胞膜+胞浆蛋白+ 细胞核 4, Wash,1xPBS,2x1min从此请保持细胞湿润 5, 室温圭寸闭1小时 封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS 条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 6, 一抗4C过夜 请用圭封闭液稀释一抗 7, 第二天 Wash,1XPBS, 2x1min 8, 二抗，1:1000 （alexa 系列）1:300 （Dyelight ）in