凝胶中回收DNA

1、实验六：凝胶中回收实验六：凝胶中回收DNADNA 酶切及感受态制备报告中存在 的问题 n原理错误 n观察不仔细,片段大小分析有误 n思考题回答不全面 一实验目的及背景一实验目的及背景 n 在生物技术实验中，反应获得的目 的片段，酶切后所得特定的序列， 分 子杂交中所制备的探针等，经过琼脂糖凝胶 电泳后，目的片段与其它分开， 这就 需要有一套方法将目的从凝胶中分离 出来，通过处理后得到纯化的目的， 以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分 析等. 从凝胶中分离回收的方法 现在常用的技术有： n低熔点琼脂糖凝胶法 n滤膜插片法等 n电洗脱法 n玻璃奶、硅胶、树脂等方法 n压碎后溶剂抽提法 低熔点琼脂

2、糖凝胶法 n羟乙基修饰的琼脂糖可以降低链间的氢羟乙基修饰的琼脂糖可以降低链间的氢 键数目，并可在比标准琼脂糖更低的温键数目，并可在比标准琼脂糖更低的温 度下融化。带有目的片段的琼脂度下融化。带有目的片段的琼脂 糖溶液进一步用有机溶剂进行抽提来回糖溶液进一步用有机溶剂进行抽提来回 收得到，或者是用琼脂糖酶消化收得到，或者是用琼脂糖酶消化 得到得到 滤膜插片法 ( (二乙基氨乙基二乙基氨乙基) )纤维素纤维素 膜带正电，而带负电膜带正电，而带负电。首首 先利用适当浓度的琼脂糖进行电先利用适当浓度的琼脂糖进行电 泳，然后紧靠目的片段条泳，然后紧靠目的片段条 带的前方切一裂缝，将带的前方切一裂缝，将

3、模插入裂缝中后继续电泳到所有模插入裂缝中后继续电泳到所有 目的条带都收集到膜上，再从裂目的条带都收集到膜上，再从裂 缝中取出膜，用低离子强度的缓缝中取出膜，用低离子强度的缓 冲液洗掉污染物，最后在高离子冲液洗掉污染物，最后在高离子 强度缓冲液中将洗脱下强度缓冲液中将洗脱下 来来 电洗脱法基本原理 n将电泳分离后含目的片段的琼脂 糖切割下来，装于透析袋中，继续在高 电压下电泳，这时目的会从凝胶 中电泳出进入透析袋中，由于分 子量大，不能透过透析袋，从而保留于 透析袋中。 n取出透析袋中含的溶液， 进一步 用酚、氯仿抽提纯化。 硅胶试剂盒法 凝胶回收试剂盒结合了硅膜技术和离心柱技凝胶回收试剂盒结合

4、了硅膜技术和离心柱技 术，在高盐低术，在高盐低PHPH状态下硅膜可高效而可逆地选状态下硅膜可高效而可逆地选 择性结合择性结合DNADNA，洗涤除去杂质，而在低盐或水，洗涤除去杂质，而在低盐或水 溶液状态下被结合的核酸能很容易地被洗脱下溶液状态下被结合的核酸能很容易地被洗脱下 来。选用的硅胶树酯或玻璃奶能专一性结合来。选用的硅胶树酯或玻璃奶能专一性结合 0.2kb0.2kb到到10kb10kb大小的大小的DNADNA（双链或单链，线性、（双链或单链，线性、 环状或超螺旋），不结合蛋白质、寡聚核苷酸、环状或超螺旋），不结合蛋白质、寡聚核苷酸、 有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有有机溶剂、去污

5、剂及其它可能抑制酶活性的有 机或无机物，提取的机或无机物，提取的DNADNA可应用于限制性酶切、可应用于限制性酶切、 PCRPCR测序，体外转录与克隆等生物学研究。测序，体外转录与克隆等生物学研究。 回收产物质量 纯度：普通级别的琼脂糖自带的一些性状不明的 多糖，会连同DNA一起从凝胶中抽提出来，强 烈抑制后继的连接、酶切、或者标记、扩增等实 验 . 产量： 完整性：避免机械剪切力使得回收产物大小不一 致 回收产物得率 回收得率产物量/电泳上样量 影响因素： 大小：DNA片断越大，和固相基质的结合力越强， 就越难洗脱，回收率就低 上样量：DNA的量越少，相对损失越大，回收率越 低 二、试剂盒组

6、成二、试剂盒组成 n1溶胶缓冲液： n2洗涤液： n3洗脱液： n4. 硅胶柱 ：Spin columnsSpin columns 三、实验设备和材料三、实验设备和材料 n无菌无菌1.5ml1.5ml离心管，各种规格移液器和无离心管，各种规格移液器和无 菌移液器吸头，凝胶回收试剂盒菌移液器吸头，凝胶回收试剂盒 ，DNADNA 混合物混合物 n恒温水浴锅，离心机，核酸电泳仪，刀恒温水浴锅，离心机，核酸电泳仪，刀 片片 四、实验步骤 n电泳 n切胶 n溶胶 n上回收柱 n洗涤 n洗脱 四、操作步骤四、操作步骤 n1. 取一干净试管，将含有目的DNA 片段的凝胶切下，并放入ep离心管中。按 照100mg凝胶加入300ul溶胶液的比例加入溶胶液 n2. 恒温水浴锅中56孵育，一般孵育10 分钟直到凝胶完全熔化（其间每隔2-3 分钟颠倒混匀一次）。 n(如果溶胶液变为红色,可加入1/10体积的3M NaAC9（ph5.2),将溶胶调为淡黄色） n3. 将胶溶液冷却到室温，然后全部加入吸附柱内。 n4. 于12000 rpm 离心1 n5. 向离心柱内加600l 洗涤液，于12000 rpm离心1，弃去接收管内液体。 n6. 重复步骤5 n7.再次于12000 rpm空离心2分钟，尽量除去