生物工艺学工业培养基及其设计

1、共28页 第1页 目录 第三章工业培养基及其设计第三章工业培养基及其设计 3.1 工业培养基的基本要求工业培养基的基本要求 3.2 工业培养基的成分及来源工业培养基的成分及来源 3.2.1 碳源碳源 3.2.2 能源能源 3.2.3 氮源氮源 3.2.4 无机盐及微量元素无机盐及微量元素 3.2.5 生长调节物质生长调节物质 3.2.6 水水 3.3 培养基类型培养基类型 3.3.1 制备培养基的基本原则制备培养基的基本原则 3.3.2 培养基的种类及其应用培养基的种类及其应用 3.4 培养基设计原理与优化方法培养基设计原理与优化方法 3.4.1 培养基的设计原理培养基的设计原理 3.4.2

2、培养基的优化方法培养基的优化方法 共28页 第2页 目录 一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基就要遵循以下一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基就要遵循以下 原则：原则： 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转 化率。化率。 有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 尽量减少副产物的形成，便于产物的

3、分离纯化。尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 原料价格低廉，质量稳定，取材容易。原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧 的利用率，降低能耗。的利用率，降低能耗。 有利于产品的分离纯化，并尽可能减少有利于产品的分离纯化，并尽可能减少 “三废三废”物质的产生。物质的产生。 3.1 工业培养基的基本要求工业培养基的基本要求 工业培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢工业培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢 产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。产物所需要的

4、，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 共28页 第3页 目录 3.2 工业培养基的成分及来源工业培养基的成分及来源 碳源碳源 水水 生长调节物质生长调节物质 无机盐及微量元素无机盐及微量元素 氮源氮源 能源能源 共28页 第4页 目录 不同营养类型的微生物利用不同的碳源。为数 众多的异养微生物常利用某类有机化合物中的 一种或几种作为它们的碳源。首先，糖类是微 生物最广泛利用的碳源，尤其是葡萄糖，其次 是醇、有机酸或脂肪酸等。而其余微生物或是 利用CO2或碳酸盐作为唯一或主要的碳源，如 蓝细菌等光能自养微生物和硝化细菌等化能自 养微生物；或是利用CO2及相对低分子质量的 简单有机物作为主要碳

5、源，如紫色非硫细菌等 光能异养微生物。 不同微生物利用碳源物质的范围也很不 相同。有的微生物利用的碳源物质范围 很广。例如，洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkholdria cepacia)可以利用90多种 不同类型的有机化合物作为碳源。而有 些微生物所能利用的碳源物质种类极其 有限。 对于为数众多的化能异养微生物来说， 碳源是兼有能源功能的双功能营养物。 3.2.1 碳源碳源 共28页 第5页 目录 能源是提供微生物生命活动所需能量的 物质。极大多数微生物的能源物质是化 学物质(有机化合物和无机化合物)。只 有光合细菌利用光作为能源。但微生物 生长过程中所涉及的能量主要是ATP形 式的化学能。即

6、使是光合细菌，也要将 光能转换成ATP形式的化学能后才可利 用。 3.2.2 能源能源 共28页 第6页 目录 氮是微生物细胞需要量仅次于碳的元素。能提 供微生物所需氮素的营养物质称为氮源。 主要功能主要功能：提供细胞原生质和其他结构物质中 的氮素，一般不作为能源使用。但化能自养细 菌中的亚硝化细菌和硝化细菌能从NH3和NO2 等还原态无机含氮化合物的氧化过程中获得其 生命活动所需的能量。 对于硝化细菌硝化细菌来说，NH3和NO2是兼有氮源与 能源功能的双功能营养物质双功能营养物质。对于异养微生物异养微生物 来说，含有C、H、O、N的有机化合物是具有 碳、能源和氮源三重功能的营养物三重功能的营

7、养物。 3.2.3 氮源氮源 共28页 第7页 目录 微生物除了需要碳源、能源和氮源之外，微生物除了需要碳源、能源和氮源之外， 还需要还需要P P、S S、K K、MgMg、CaCa、NaNa、FeFe、CoCo、ZnZn、 MoMo、MnMn、NiNi和和W W等元素，大多是以无机盐的等元素，大多是以无机盐的 形式提供的，故称为无机盐或矿物质元素。形式提供的，故称为无机盐或矿物质元素。 大量元素：大量元素：需要浓度在需要浓度在1010-3 -3 1010-4 -4mol/L mol/L范围范围 内的元素，如内的元素，如P P、S S、K K、MgMg、CaCa、NaNa和和FeFe等；等；

8、微量元素：微量元素：需要浓度在需要浓度在1010-6 -6 1010-8 -8mol/L mol/L范围范围 内的元素，如内的元素，如CoCo、ZnZn、MoMo、MnMn、NiNi和和W W等。等。 3.2.4 无机盐及微量元素无机盐及微量元素 生理功能：生理功能： 提供微生物细胞化学组成中提供微生物细胞化学组成中(除除C和和N外外)的重要元素，的重要元素， 如如P核酸的重要组成元素；核酸的重要组成元素； 参与并稳定微生物细胞的结构，如参与并稳定微生物细胞的结构，如P参与的磷脂双参与的磷脂双 分子层构成了细胞膜的基本结构等；分子层构成了细胞膜的基本结构等； 与酶的组成和活力有关。如与酶的组成

9、和活力有关。如Fe是细胞色素氧化酶的是细胞色素氧化酶的 必要组分等；必要组分等； 调节和维持微生物生长过程中诸如渗透压、氢离子调节和维持微生物生长过程中诸如渗透压、氢离子 浓度和氧化还原电位等生长条件；浓度和氧化还原电位等生长条件； 用作某些化能自养细菌物能源物质，如用作某些化能自养细菌物能源物质，如NO2 被硝 被硝 化细菌用作能源；化细菌用作能源； 用作呼吸链末端的氢受体，如用作呼吸链末端的氢受体，如NO3 被硝酸盐还原 被硝酸盐还原 细菌用作无氧呼吸时呼吸链末端的氢受体。细菌用作无氧呼吸时呼吸链末端的氢受体。 共28页 第8页 目录 许多微生物除了需要碳源、能源、氮源 与无机盐之外，还必

10、须在培养基中补充 微量的有机营养物质才能生长或者生长 良好，这些微生物生长所不可缺少的微 量有机物质就是生长因子生长因子。生长因子有 维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱、卟 啉及其衍生物、固醇、胺类、C2C6直 链或分支脂肪酸等。一些特殊的辅酶也 能用作生长因子。 3.2.5 生长调节物质生长调节物质 生长因子的主要功能主要功能是提供微生物细胞重要化学 物质(蛋白质、核酸和脂质)、辅因子(辅酶和辅基) 的组分和参与代谢。 但是，有些微生物可以合成并分泌大量维生素等 生长因子，因此，可用作维生素等生产菌，例如， 利用阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉阿舒 囊霉(Ashbya

11、 gossypii)生产维生素B2，用作B12生产 菌的有谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、 橄榄链霉菌(Strep-tomyces oliuaceus)、灰色链霉菌 (S.griseus)与巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)等。 共28页 第9页 目录 水以自由水与结合水两种形式存在。结合水 没有流动性和溶解力，所以微生物不能利用 它。水的可利用性常用水活度(aw)来表示： 水活度以相同温度下，溶液或物质上面空气 的蒸汽压与纯水蒸汽压之比表示： 水活度(aw)=P溶液/P纯水 纯水的aw值为1。有溶质时，水活度就低于1。 水

12、是微生物营养中不可缺少的物质，主要是因为：水是微生物营养中不可缺少的物质，主要是因为： 水是微生物细胞的主要化学组成； 水是营养物质和代谢产物的良好溶剂，营养物质与 代谢产物都是通过溶解和分散在水中而进出细胞的； 水是细胞中各种生物化学反应得以进行的介质，并 参与许多生物化学反应；水的比热高，汽化热高， 又是热的良好导体，保证了细胞内的温度不会因代 谢过程中释放的能量骤然上升； 水还有利于生物大分子结构的稳定。 3.2.6 水水 共28页 第10页 目录 3.3 培养基类型培养基类型 3.3.1 制备培养基的基本原则制备培养基的基本原则 条件适宜条件适宜 微生物的生长除了取决于营养之外， 还受

13、pH、氧气、渗透压等物理化 学因素的影响，而微生物的生长反 过来又会影响环境条件。为使微生 物良好地生长、繁殖或积累代谢产 物，必须创造尽可能适宜的生长条 件。 目标明确目标明确 营养协调营养协调 经济合理经济合理 条件适宜条件适宜 pH 渗透压及 其他条件 目标明确目标明确 根据培养的对象和目的，如 培养何菌，获何产物，用于 实验室还是大规模生产以及 作种子培养用还是发酵用来 制备培养基。 渗透压渗透压 培养嗜盐微生物培养嗜盐微生物(如嗜盐细菌如嗜盐细菌)和嗜渗和嗜渗 透透 压微生物压微生物(如高渗酵母如高渗酵母)时就要提高培养基时就要提高培养基 的渗透压。培养嗜盐微生物常加适量的渗透压。培

14、养嗜盐微生物常加适量 NaCl，海洋微生物的最适生长盐度约，海洋微生物的最适生长盐度约 3.5%。培养嗜渗透压微生物时要加接近。培养嗜渗透压微生物时要加接近 饱和量的蔗糖。饱和量的蔗糖。 营养协调营养协调 培养基应含有维持微生物 最适生长所必须的一切营 养物质。但更重要的是， 营养物质浓度与配比要合 适，就是要做到培养基营 养协调。 pH 最适pH：细菌7.08.0，放线菌7.58.5， 酵母菌3.86.0，霉菌4.05.8。 培养基pH可以通过加入碱性或酸性化合物 NaOH和HCl来调节。 通常可加入缓冲液或微溶性碳酸盐。常用 由一氢与二氢磷酸盐(如K2HPO4与KH2PO4) 的等摩尔溶液

15、(pH6.8)组成的磷酸缓冲液。 此外，通常还要在培养基中加入作为指示 剂的染料以指示培养基的pH变化。 共28页 第11页 目录 3.3.2.1 根据所培养微生物的类群与营养类型区分根据所培养微生物的类群与营养类型区分 3.3.2 培养基的种类及其应用培养基的种类及其应用 3.3.2.2 根据对培养基成分的了解程度区分根据对培养基成分的了解程度区分 3.3.2.3根据制备后培养基的物理状态区分根据制备后培养基的物理状态区分 3.3.2.4根据培养基的功能区分根据培养基的功能区分 共28页 第12页 目录 细菌培养基 放细菌培养基 酵母菌培养基 霉菌培养基 自养微生物培养基 异养微生物培养基

16、3.3.2.1 按培养微生物与营养类型区分按培养微生物与营养类型区分 共28页 第13页 目录 合成培养基合成培养基 -化学成分确定 3.3.2.2 按按对培养基成分的了解程度区分对培养基成分的了解程度区分 半合成培养基半合成培养基 -化学成分部分确定 天然培养基天然培养基 -化学成分不确定 用纯化学试剂和天然物质可 配制成半合成培养基半合成培养基，如培 养真菌用的马铃薯蔗糖培养 基。 天然培养基天然培养基采用动植物组织 或微生物细胞或它们的提取 物或粗消化产物配制而成的。 （牛肉膏蛋白胨培养基） 优点：优点：所用物质取材方便，营 养丰富，而且配制方便。 缺点：缺点：所用物质的成分不稳定， 因

17、而营养成分难以控制，实 验结果的重复性差。 合成培养基合成培养基是通过顺序加入准确 称量的高纯化学试剂与蒸馏水配 制而成的，其所含成分(包括微量 元素在内)以及它们的量都能确切 地知道。（异养微生物培养基） 优点：优点：化学成分确定并精确定量， 实验的可重复性高； 缺点：缺点：配制较烦，成本较高。 应用：应用：实验室中进行的营养、代 谢、遗传育种、鉴定和生物测定 等定量要求较高的研究。 共28页 第14页 目录 呈液态的培养基为液体培养液体培养 基基。它广泛用于微生物学实 验和生产，在实验室中主要 用于生理、代谢研究和获得 大量菌体。在发酵生产中极 大多数发酵培养基为液体培 养基。 固体培养基

18、固体培养基 3.3.2.3 按制备后培养基的物理状态区分按制备后培养基的物理状态区分 液体培养基液体培养基 半固体培养基半固体培养基 如在液体培养基中加0.5%或 更低浓度的琼脂就制成柔软 的浆糊状半固体培养基，它 们用于微好氧细菌的培养或 细菌运动能力的确定。 固体培养基固体培养基(呈固体状态的培养基)， 有加凝固剂后制成的；有直接用天然 固体状物质制成的；还有在营养基质 上覆上滤纸或滤膜等制成的。 常用的固体培养基常用的固体培养基是在液体培养基中 加入琼脂(约2%)或明胶(5%12%)， 加热到100，然后再冷却并凝固的培 养基。 天然固体培养基天然固体培养基直接用某些天然固体 状物质制成

19、，如培养真菌用麸皮、大 米、玉米粉和马铃薯块培养基。取材 和制备都很方便，为生产所常用。 共28页 第15页 目录 选择培养基选择培养基 3.3.2.4 按培养基的功能区分按培养基的功能区分 选择培养基选择培养基通过加入不防碍目的微生 物生长而抑制非目的微生物生长的物 质以达到选择的目的。常用抑制物质常用抑制物质 有有染料和抗生素。如分离真菌用的马 丁氏培养基中加有抑制细菌生长的孟 加拉红、链霉素和金霉素等。 选择培养基选择培养基也可通过在培养基中加入 目的微生物特别需要的营养物质而使 它们加富以达到选择目的。这种选择 培养基就是加富培养基加富培养基。用于加富的 营养物质通常是碳源和氮源，例如

20、富 集纤维素分解菌选用的纤维素等。 选择压力培养基选择压力培养基 鉴别培养基鉴别培养基 鉴别培养基鉴别培养基是一类在培养基中 添加某种化学物质而将目的或 对象微生物的菌落与同一平板 上的其他微生物菌落区别开来 的培养基。用于鉴别肠道杆菌 中某些细菌的伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基 是最好的例子。 现代基因克隆技术中，基因工程的载体 上常带有各种遗传学标记，当这样的载 体携带目的基因转入受体菌时，由于标 志基因所对应的遗传表型与受体菌是互 补的，因此在培养基中施加合适的选择在培养基中施加合适的选择 压力压力，将受体菌接入这种选择压力培养 基，形成菌落的受体菌就是克隆子克隆子，即 基因工程目的菌，而

21、非克隆子则不生长。 遗传学标记可以是氨苄青霉素抗性基因、 四环素抗性基因、红霉素抗性基因等， 相应的选择压力培养基中除了加入合适 的营养成分外，再加入氨苄青霉素、四 环素、红霉素等。 共28页 第16页 目录 伊红美蓝培养基中的伊红和美蓝的作用：伊红美蓝培养基中的伊红和美蓝的作用： 鉴别染色，鉴别染色，伊红是一种红色酸性染料，美蓝是一种 蓝色碱性染料。大肠杆菌能强烈分解乳糖产生大量有 机酸，结果与两种染料结合形成深紫色菌落。由于伊 红还发出略呈绿色的荧光，因此在反射光下可以看到 深紫色菌落表面有绿色金属闪光。而肠道内的沙门氏 菌和志贺氏菌不发酵乳糖，所以形成无色菌落。这样 就可以将无害的大肠杆

22、菌与致病的沙门氏菌和志贺氏 菌区别开来。 抑制某些细菌抑制某些细菌(革兰氏阳性细菌与一些难以培养的革 兰氏阴性细菌)生长的作用。此外，这两种染料在pH值 低时结合形成沉淀，可起产酸指示剂的作用。 伊红美蓝培养基在饮用水、牛乳的细菌学检查以及 遗传学研究上有着重要的用途。 共28页 第17页 目录 3.4 培养基设计原理与优化方法培养基设计原理与优化方法 3.4.1 培养基的设计原理培养基的设计原理 菌体的同化能力 培养基对菌体代谢的阻遏与诱导影响 碳氮比对菌体代谢调节的重要性 pH值对不同菌体代谢的影响 共28页 第18页 目录 有些微生物由于水解酶系的缺乏只能够利用简单的物 质，而有些微生物

23、则可以利用较为复杂的物质。因而 在考虑培养成分选择的时候，必须充分考虑菌种的同 化能力，从而保证所选用的培养基成分是微生物能够 利用的。 在选取用淀粉、黄豆饼粉这类原料作为培养基时，必 须考虑微生物是否具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能 力。 葡萄糖是几乎所有的微生物都能利用的碳源，因此在 培养基选择时一般被优先考虑，但工业上如果直接选 用葡萄糖作为碳源，成本相对较高，一般采用淀粉水 解糖。在工业生产上，将淀粉水解为葡萄糖的过程称 为淀粉的糖化，所得的糖液称为淀粉水解糖液。 菌体的同化能力菌体的同化能力 共28页 第19页 目录 谷氨酸发酵生产中水解糖液的质量指标谷氨酸发酵生产中水解糖液的质量指标

24、 项项 目目质量要求质量要求 色泽浅黄色、杏黄色，透明 糊精反应无 还原糖含量18%左右 葡萄糖值(DE值)90%以上 透光率60%以上 pH4.64.8 共28页 第20页 目录 不同糖化工艺所得糖液质量比较 项目项目酸法酸法酸酶法酸酶法双酶法双酶法 葡萄糖(DE值)/%919598 葡萄糖含量/干重/%869397 灰分/%1.60.40.1 蛋白质/%0.080.080.10 色度/%0.300.0080.003 羟甲基糠醛10.00.30.2 葡萄糖收得率/%8090比酸法高5%比酸法高10% 共28页 第21页 目录 培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影

25、响 碳碳 源源 生物量生物量 /(g/L) -淀粉酶淀粉酶 活力活力 /(U/mL) 果胶酶活果胶酶活 力力 /(U/mL) 葡萄糖4.200.77 果糖4.1800 蔗糖4.0200.66 糊精3.0638.20.52 淀粉3.0940.21.92 葡萄糖效应，葡萄糖效应，亦 “葡萄糖分解阻遏 作用” ，是指当 菌种利用葡萄糖时 产生的分解代谢产 物会阻遏或抑制某 些产物合成所需的 酶系的形成或酶的 活性的作用。 碳源对地衣芽孢杆菌和黑曲霉生长和产酶的影响 共28页 第22页 目录 碳氮比对菌体代谢调节的重要性 培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的 影响极为显著。氮源过多，会使菌体生长

26、过于旺 盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不 足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多 则容易形成较低的pH；若碳源不足则容易引起 菌体的衰老和自溶。 微生物在不同的生长阶段对碳氮比的最适要求 也不一样。一般来讲，因为碳源既作为碳骨架参 与菌体和产物的合成又作为生命过程中的能源， 所以比例要求比氮源高。 共28页 第23页 目录 pH值对不同菌体代谢的影响 微生物的生长和代谢除了需要适宜的营养环境外， 其他环境因子也应处于适宜的状态。其中pH就是 极为重要的环境因子。 合理配制培养基是保证发酵过程中pH能满足工艺 要求的决定因素之一。因而在选取培养基的营养 成分时，除了考虑营养的需求外

27、，也要考虑其代 谢后对培养体系pH缓冲体系的贡献，从而保证整 个发酵过程中pH能够处于较为适宜的状态。 共28页 第24页 目录 确定发酵培养基的思路步骤 首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生 长规律、生理生化特性和一般的营养要求。 其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途 径，代谢产物的化学性质、分子结构，提取方法和 产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养 基时做到心中有数。 最好先以一种较好的化学合成培养基为基础，先做 一些摇瓶试验，然后进一步做小型发酵罐培养，摸 索菌种对各种主要营养物质，在合成培养基上得出 一定结果后，再做复合培养基试验；最后通过试验 确定各种发酵条件

28、和培养基的关系。 共28页 第25页 目录 培养基设计与优化过程一般要经过以下几个步骤：培养基设计与优化过程一般要经过以下几个步骤： 根据以前的经验以及培养基成分确定时必须考虑的一些问题， 初步确定可能的培养基组分； 通过单因素优化实验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适 浓度； 最后通过多因子实验，进一步优化培养基的各种成分及其最适 浓度。 培养基不仅影响产物的产率，而且还可能影响产物的组成和产培养基不仅影响产物的产率，而且还可能影响产物的组成和产 量，因此要对培养基进行优化。量，因此要对培养基进行优化。 在实际的生产中，培养基的优化通常和培养条件的优化紧密结在实际的生产中，培养基的优化通常

29、和培养条件的优化紧密结 合在一起，所以微生物发酵培养基的优化需要同时注重两个方合在一起，所以微生物发酵培养基的优化需要同时注重两个方 面的内容：一是对培养基进行优化，二是对发酵的条件，如温面的内容：一是对培养基进行优化，二是对发酵的条件，如温 度、度、pH、通气量、搅拌速度等发酵条件进行优化和控制。、通气量、搅拌速度等发酵条件进行优化和控制。 3.4.2 培养基的优化方法培养基的优化方法 共28页 第26页 目录 本章小结 工业培养基的成分及来源 培养基的不同分类 培养基的设计原理与优化步骤 共28页 第27页 目录 氮是微生物细胞需要量仅次于碳的元素。能提 供微生物所需氮素的营养物质称为氮源。 主要功能主要功能：提供细胞原生质和其他结构物质中 的氮素，一般不作为能源使用。但化能自养细 菌中的亚硝化细菌和硝化细菌能从NH3和NO2 等还原态无机含氮化合物的氧化过程中获得其 生命活动所需的能量。 对于硝化细菌硝化细菌来说，NH3和NO2是兼有氮源与 能源功能的双功能营养物质双功能营养物质。对于异养微生物异养微生物 来说，含有C、H、O、N的有机化合物是具有 碳、能源和氮源三重功能的营养物三重功能的营养物。 3.2.3 氮源氮源 共28页 第28页 目录 呈液态的培养基为液体培养液体培养 基基。它广泛用于微生物学实 验和生产，在实验室中主要 用于生理、代谢研究和获得 大量菌