实时荧光定量PCR实验结果分析

1、邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司 u定量分析 绝对定量 相对定量 u定性分析 SNP分析，基因扫描 阴阳性判定 熔解曲线分析 绝对定量：How Many 优点：给出目标基因初始模板 的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品，做标准 曲线 应用：病毒拷贝数；转基因的 拷贝数；转基因成分百分含量检 测 相对定量:How Much 优点：需要/不需要标准品； 使用广泛 缺点：数据理解困难 应用：差异表达分析；芯片评 估 14500 copies 108106102104 108106102104 T 108106102104 T 10105 5 copies/well copies/we

2、ll 1/3 Blank 1/31/31/3 1.11 ng/2ul 0.37 ng/2ul 0.12 ng/2ul10.0 ng/2ul 3.33 ng/2ul T Control CT = 21.3 Sample A CT = 22.8 Sample B CT = 19.3 Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1 Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33 Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4 Fold 管家基因校准(Normalization Gene) 得出每个细胞中的目的基因 目标基因v

3、s. 管家基因 对照样品校准(Calibrator Sample) 得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. 处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常. 目标基因 管家基因 处理后 处理前 ERBB2 GAPDH Sample Calibrato r 按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度 至少需要两个标准曲线 GOI reference gene 标准曲线确定反应扩增效率 依据：平均相对含量% = 2 平均CT 数据处理： C（t）GOI- C（t）ref= C（t） C（t）sample- C（t）calibrator= C（t） 好处

4、：不做标准曲线 应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一 致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估） ；不要求很高的精度 RNA提取 RT-qPCR实验 结果分析 RNA定量 反转录(RT) 设计qPCR实验方法 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常， 因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 标准品（质粒）构造标准曲线 多重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（监控基因组污

5、染） Experion RNA StdSens Chip 5-500 ng/ml 100-6,000 nt Experion RNA HighSens Chip 0.1-5 ng/ml 100-6,000 nt 乳癌组织 RNA 正常乳腺组织 RNA 5 hr. at 90CIntactIntact 7 hr. at 90C Intact 7 hr. degradati on GAPDH gene Intact 5 hr. degradation 在不同的反应管中运行RT & PCR 1. 反转录反应 加热灭活反转酶 2. PCR 反应 2. PCR 反应 1.反转录反应 25C 5 min

6、42C 30 min 85C 5 min 冷却至4C iScript cDNA Synthesis Kit 定性条件摸索 荧光化学物质 SYBR GREEN染料 Taqman探针 定量PCR条件优化 单双通道相互验证 qFam标记目标基因探针 qVIC标记看家基因探针 动态温度梯度动态温度梯度 5-6oC Below 10oC Above 预设退火温度预设退火温度 Real annealing range 95C,15min 94C,15sec 60C,1min plate read go to step 3,39 more times 10C,forever End 目标基因： 未知样品 生

7、成标准曲线： 标准品梯度 监控系统故障： 阳性对照 监控污染： 阴性对照/基因组对照 校准生物学误差：看家基因 降低其余误差： 重复实验 Color 2 - VIC detection for GAPDH Color 1 FAM detection for ERBB2 ERBB2单双通道相互验证的实验结果 A.Multiplex Reactions Healthy RNACarcinoma 28.4826.42 28.6826.98 28.7826.98 28.65 0.1526.80 0.32 B.Singleplex reactions Healthy RNACarcinoma 28.67

8、27.09 28.7126.68 28.7326.70 28.70 0.0326.82 0.24 样品扩增：正常vs肿瘤 PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH 肿瘤肿瘤 正常 Healthy RNA Tumor RNA GAPDH ERBB2 1095 1052 2130 2492 95500 85730 136000 130800 Copies ng/ l Total RNA ERBB2 copies / GAPDH copies 1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012 2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.0197 Healthy RNA Tumor RNA 0.011 0.018 0.018/ 0.0111.63 Healthy Tissue Carc. Tissue Relative Expression 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 C(t)=4.41-5.18 =-0.770.18 2-c(t) =1.511.93 结果与双标准曲线法相近结果与双标准曲线法相近 Healthy RNA BBER2GAPDHC(t) 28.4023.275.