增强免疫力功能评价方法及修订说明

1、附件1:增强免疫力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Prin ciples and Result Assessme nt1试验项目1.1动物实验1.1.1体重1.1.2脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值，脾脏/体重比值1.1.3细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5单核一巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光 微球实验1.1.6 NK细胞活性测定 2试验原则2.1所列的指标均为必做项目2.2分为正常动物实验方案和免疫功能低下模型动物实验两

2、种方案，可任选其一进行实验.2.3采用免疫功能低下动物模型实验方案时需做外周血白细胞总数测定 3结果判定3.1采用正常动物实验，受试样品具有增强免疫力作用。在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及NK细胞活性四个方面测定中，任两个方面试验结果为阳性，可以判定该受试样品具有增强免疫力 作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定细胞免疫功能试验结果阳性。体液免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，判定体液免疫功能试验结果阳性。单核一巨噬细胞功能测定项目中两个实验的结果均为阳 性，判定单核一巨噬细胞功能试验结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，判定NK细

3、胞活性结果阳性。正常动物实验需进行四个方面的测定。3.2采用免疫功能低下动物实验，受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作 用。在免疫功能低下模型成立条件下，血液白细胞总数、细胞免疫功能、体液免 疫功能、单核-巨噬细胞功能及 NK细胞活性五个方面测定中，任两个方面试验 结果为阳性，判定该受试样品对免疫功能低下者具有增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能试验结果阳性。 体液免疫功能测定项目 中两个实验的结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液 免疫功能试验结果阳性。单核一巨噬细胞功能测定项目中两个实

4、验的结果均为阳 性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核一巨噬细胞功能试验结果 阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量结果阳性，可以判定 NK细胞活性结 果阳性。血液白细胞总数测定的二个以上剂量结果阳性，可以判定血液白细胞总 数结果阳性。免疫功能低下模型动物实验至少需进行三个方面的测定。同时在各项实验 中，任何一项测试都不出现加重免疫抑制剂作用的结果。增强免疫力功能检验方法Method for the Assessment of Enhancing Immune Function1. 原理：免疫系统主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴组织和全身各处的淋巴细 胞、抗原呈递细胞等，还包括血液

5、中的白细胞。淋巴细胞经血液和淋巴使各 处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体。胸腺属中央淋巴器官，主要功能 是确保T淋巴细胞的产生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性细 胞；脾脏对抗原发生免疫应答作用，脾窦的巨噬细胞具有清除功能，脾白髓含有 记忆B细胞，产生对T依赖抗原的体液免疫应答。淋巴细胞是特异性免疫应答的 主要细胞群，按其表面标志物，分为 T细胞、B细胞和天然杀伤细胞（NK三大 类，T细胞又分为CD4 （Th）细胞和CD8T淋巴细胞。B淋巴细胞转化为浆细胞后 能合成和释放抗原特异抗体，所有抗体都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋 白分子都具有抗体功能。免疫系统可产生特异性免疫和

6、非特异性免疫功能，检测 上述免疫系统的各种代表性指标的改变可对增强免疫力作用的功能做出相应判定。2. 实验动物选择推荐用近交系小鼠，如 C57BL/6J、BALB/C等，68周龄，1822g （ BALB/C 种可16-18g），单一性别，雌雄均可，每组 1015只。3. 剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和1个阴性对照组。以人体推荐量的10倍为其中一个剂 量，另设二个剂量组。必要时设阳性对照组。选做免疫低下模型法时，应设模型 对照组。受试样品给予时间四周或 30天。4 免疫功能低下动物模型可选用环磷酰胺、氢化可的松或其他合适的免疫抑制剂进行药物造模。4.1造模原理: 4.1.1环磷酰

7、胺主要通过DNA烷基化破坏DNA的合成而非特异性地杀伤淋巴细 胞，并可抑制淋巴细胞转化；环磷酰胺对B细胞的抑制比T细胞强，一般对体液 免疫有很强的抑制作用，对NK细胞的抑制作用较弱。4.1.2氢化可的松主要通过与相应受体结合成复合物后进入细胞核，阻碍NF-k B进入细胞核，抑制细胞因子与炎症介质的合成和释放，达到免疫抑制目的。氢化可的松还可损伤浆细胞，抑制巨噬细胞对抗原的吞噬、处理、和呈递作用，所以 氢化可的松对细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。4.2免疫抑制剂剂量选择环磷酰胺可选择40mgT kg，腹腔注射，连续两天，末次注射给药后第5天测定各项指标；氢化可的松

8、可选择 40mg/kg，肌内注射，隔天一次，共 5次， 末次注射给药后次日测定各项指标。各指标对两种模型敏感性不同，环磷酰胺模型比较适合抗体生成细胞检测、血清溶血素测定、白细胞总数测定；氢化可的松模型比较适合迟发型变态反应、 碳廓清实验、腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验、NK细胞活性测定，建议根据不同的免疫功能指标选择合适的模型。4.3受试物给予连续给予受试物4周或30天，在第3周后开始给予免疫抑制剂，进行模型 与预防性给药相结合的实验。5.实验方法5.1血液白细胞数测定小鼠外周血白细胞总数和淋巴细胞数检测方法 （仪器法）全血用EDTA K2抗凝后经血细胞分析仪检测，可测定白细胞数量，并可对 白细

9、胞进行分分类计数。5.1.1仪器和材料乙二胺四乙酸二钾（EDTA K2 - 2HO, MW404.47,离心管，全血细胞分析仪 上样管，眼科镊子，振荡器，加样枪，冷冻离心机，全血细胞分析仪。5.1.2实验步骤5.121试剂配制血液抗凝：EDTA&能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝 固，1.52.2mg的EDTA &可阻止1ml血液凝固。抗凝剂配制：称量8mg EDTA K2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50卩抗凝 剂可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或 双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（

10、或商品化的抗凝管）中, 采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。5.1.2.3检测分析上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h内以全血细胞分析仪 检测白细胞总数和淋巴细胞数。上机操作参照仪器说明书。5.1.3数据分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先进行方差齐性检验， 方差齐，计算 F值，p 0.05，结论：各组均数间差异无显著性意义；F值Fo.05，PW 0.05，用 多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计； 对非正态或方差不齐 的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进 行统计；若变量转换后仍未达到正态或

11、方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的白细胞总数显著高于阴性对照组，可判定该项实验结果阳性。5.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一5.2.1 MTT 法5.2.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞增殖反应，活细胞特别是增殖细胞 通过线粒体水解酶将MTT（ 种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其 光密度值能反映细胞的增殖情况。5.2.1.2 仪器和材料RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、 刀豆蛋白A （ConA、盐酸、异丙醇、MTT Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4 ）纱布、200目

12、筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、大号注 射器内芯、二氧化碳培养箱、酶标仪、分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、 无菌滤器。521.3 实验步骤52131试剂配制完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1 %谷 氨酰胺（200mmol/L）,青霉素（100U/mL），链霉素（100ug/L、及 5X 10一5mol/L 的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即 完全培养液。Co nA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20 C） 保存。无菌Hanks液 用前以3.5

13、%的无菌NaHCOS pH7.2-7.4。MTT液 将5mgMT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl,临用前配制。5.2.1.3.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量（3-5ml、无菌Hanks液平皿中，并在脾上面放置 一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网 过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min （1000r/min、。然后将细胞悬浮于 2mL的完全培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞，或用台酚兰染色计数活 细胞数（应在95%上），调整细胞浓度为3X 106个/mL。5.2.

14、1.3.3 淋巴细胞增殖反应将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75卩1 onA液（相 当于7.5 pg/mL），另一孔作为对照，置5%CO, 37C CO孵箱中培养72h。培养结 束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培 养液，同时加入MTT（5mg/mL 50 p l孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入 1mL酸性异丙醇，超声震荡（2秒）或人工吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然 后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以 570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 2mL比色杯中，分光光度计上

15、 在波长570nm测定OD值。521.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fo.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值Fo.5,P 0.05,用 多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加Co nA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能 力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。5.2.1.5 注

16、意事项ConA的浓度很重要，浓度过低不能刺激足够的细胞增殖，浓度过高会抑制 细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳浓度。5.2.2 XTT 法5.2.2.1 原理由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，且溶解甲臜的有机溶剂有毒 性，可选择XTT法替代MTT法。其原理是：XTT是二甲氧唑黄，在电子耦合 试剂存在的情况下，活细胞线粒体中的脱氢酶可将黄色的XTT还原成水溶性的橘黄色的甲臜，生成的甲臜能够溶解在组织培养基中，不形成颗粒，可直接用酶 联免疫检测仪检测定吸光值。522.2实验步骤脾细胞悬液制备同MTT法；淋巴细胞增殖反应：调整细胞浓度为 5X 107，取细胞悬液100卩1

17、分别加入 96孔培养板中，一孔加510 Co nA液，另一孔作为对照，设2个平行孔，置 37C 5%CO饱和湿度孵箱中培养 72h。培养结束前4h,向各孔中加入2050 1 的XTT工作液（按试剂盒说明现用现配），孵育4小时。用酶标仪在450nm波 长处检测每孔的光密度。5.2.2.3 数据处理及结果判定般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐, 计算F值，F值Fo.o5,结论：各组均数间差异无显著性；F值F.05,P 0.05,用 多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计； 对非正态或方差不齐 的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据

18、进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加Co nA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能 力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。522.4 注意事项细胞浓度及培养时间在实验前要预试，以找到最佳效果。5.2.3溴脱氧尿嘧啶核苷标记酶联免疫吸附测定法 （BrdU-ELISA法）5.2.3.1 原理T 淋巴细胞在有丝分裂原ConA等的刺激下产生增殖反应，BrdU可竞争掺入 到增殖细胞中新合成的DNA链内，将BrdU标记的细胞作为抗原结合到固相载体 表面，加入酶连接的抗-BrdU抗体，使BrdU抗原与酶

19、标抗体充分结合，抗原抗 体复合物与底物作用后产生有色物质，其光密度可反映细胞增殖的程度。5.2.3.2 仪器和材料低温离心机，全自动酶标仪、超净工作台、二氧化碳培养箱、96孔培养板（平底）、倒置显微镜、移液器、手术器械、200目筛网、细胞活性分析仪；RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ Co nA、Ha nks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4 ）、BrdU细胞增殖检测试剂盒（ELISA）、纯净水、终止液。5.2.3.3 实验步骤5.2.3.3.1 试剂配制完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨 酰胺（200mmol/L），

20、青霉素（100U/mL），链霉素（100 pg/L、及 5X 10_5mol/L 的 2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完 全培养液。ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20 C） 保存。无菌Hanks液 用前以3.5 %的无菌NaHCOS pH7.2-7.4BrdU标记液 将标记剂（试剂盒No.1）按1: 100的比例加到培养液中混匀， 现配现用。抗体贮存液（母液）在Anti-BrdU-POD （试剂盒No.3）中加1.1ml双蒸水充分混合，存于-20 C备用。抗体工作液 每100卩抗体母液加10

21、ml抗体稀释液（试剂盒No.4）,现配现 用。洗液 每10ml清洗缓冲液（试剂盒No.5）加100ml双蒸水。52332脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks液平皿中，并在脾上面放置一块纱布， 用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hanks液洗2次，每次离心10min （1000r/min ）。然后将细胞悬浮于2mL的完全 培养液中，用全自动细胞计数仪计数脾细胞， 或用台酚兰染色计数活细胞数 （应 在95鸠上），调整细胞浓度为2X 107个/mL。5.2.3.3.3 淋巴细胞培养将细胞加入96孔培养板中，10卩/1孔，每份细胞加2孔，第1孔再加入

22、90门640 培养液，第2孔加入85门640培养液和5.3卩Co nA,同时设3个空白孔，每孔 仅加100卩11640培养液，置5%CO 37E培养箱孵育72h，培养结束前4 h加入 BrdU标记液，10卩/孔，培养结束后离心（1000r/min,10min ）,弃上清，吹干细 胞，放4 C冰箱保存待测。5.2.3.3.4 酶联免疫吸附测定每孔加200卩固定液，常温放置30min后，吸弃固定液。加入100卩BrdU抗 体工作液，37C孵育60min；吸弃未结合的抗体，力卩250卩洗液洗3次，轻拍移 去洗液。加底物溶液（含TMB 100卩/孔，常温孵育15mi n。用酶标仪测量吸光 值，不加终止

23、液时，测定发射波长为370nm （记为為。），参考波长492nm （记为A492）;加终止液时，测定发射波长为 450nm （记为 氐。），参考波长690nm （记为 A690）。5.2.3.4 数据处理及结果判定计算每孔标记指数（LI ）， LI= （ A370- A空白370）- （A492- A 空白 492 ）或 LI= （A 50-A空白450） -（ Aj90- A空白690）。用加Co nA孔的LI值减去不加Co nA孔的LI值所得 的差值代表淋巴细胞的增殖程度。采用方差分析对标记指数差值进行统计学分析，按方差分析的程序先进行方 差齐性检验，方差齐，计算 F值，F值 Fo.o5，

24、则各组均数间差异无显著性；F 值Fo.05,P 0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计； 对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后， 用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的LI值差值显著高于对照组的LI值差值，可判定该项实验结果 阳性。523.5 注意事项选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用， 不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。5.3迟发型变态反应（DTH迟发型变态反应是细胞免疫的体内检测法，当致敏 T细胞再次与抗原接触， 引

25、起T细胞活化，释放出多种细胞因子，致局部组织发生以单核细胞为主的炎症 反应，一般在2448h达高峰。可任选下列方法之一试验。5.3.1二硝基氟苯诱导小鼠DTH（耳肿胀法）5.3.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47d后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后2448h达高峰，其肿胀程度可以反映迟发型变态反 应程度。5.3.1.2 材料DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。5.3.1.3 实验步骤5.3.1.3.1 试剂配制DNFBS液DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg置清洁干燥小瓶中，将 预

26、先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1: 1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶 布密封。混匀后，用250卩注射器通过瓶盖取用。0 致敏 每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约 3cmX 3cm用DNFB溶 液50卩均匀涂抹致敏。1 DTH的产生与测定5天后，用DNFB溶液10卩均匀涂抹于小鼠右耳 （两面）进行攻击。攻击后 24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。5.3.1.4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fo.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P 0.05,用 多个实验组和一个

27、对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照 组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。5.3.1.5 注意事项：操作时应避免DNFBW皮肤接触。5.3.2绵羊红细胞（SRBC诱导小鼠DTH（足跖增厚法）5.3.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时， 攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。5.322 仪器与材料游标卡尺（

28、精密度0.02mm、SRBC微量注射器（50卩）、足趾容积测量仪。5.323 实验步骤5.3.2.3.1 致敏 小鼠用2% （v/v）SRBC腹腔或静脉免疫，每只鼠注射0.2mL（约 1 X 108个 SRBC。53232 DTH 的产生与测定 免疫后4天，测量左后足跖部厚度或肿胀度， 然后在测量部位皮下注射 20% （v/v）SRBC，每只鼠20 1 （约1X 108个SRBC， 注射后于24h测量左后足跖部厚度或肿胀度，同一部位测量三次，取平均值。测量方法：用游标卡尺测量肉眼读数。或用足趾容积测量仪进行测量足跖部 肿胀度，操作方法按仪器操作指引进行。532.4数据处理和结果判定一般采用方差

29、分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fo.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F.05,P 0.05,用 多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度或肿胀度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。5.3.2.5 注意事项前后两次测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加 压，否则会影响测量结果。攻击时所用的S

30、RB（要新鲜（保存期不超过1周）。5.4抗体生成细胞检测（改良法）5.4.1 原理溶血空斑试验是检测产生IgM、IgG等抗体分泌细胞数体外试验法。用绵羊 红细胞（SRBC免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的 SRBC昆合，在补体参与下， 使抗体分泌细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。5.4.2仪器和材料溶血空斑自动图象分析仪、二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、 200目筛网、SRBC补体（豚鼠血清）、Hanks液、RPMI1640培养液、SA缓冲液（GH2Q 0.46g, MgCb 0.1g, CaCb.2H2O 0.2g, NaCI 8.38g, NaHCO0.252g and

31、GHnNNaO0.3g, 加蒸馏水至1000mL、灭菌生理盐水、琼脂糖。5.4.3实验步骤：5.4.3.1 SRBC 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中， 朝一 个方向摇动，以脱纤维，生理盐水 2500rpm/min，15min，洗涤3次，制备压积 SRBC放入4 C冰箱保存备用。5.4.3.2 完全培养基的制备：新生小牛血清经绵羊红细胞（v/v，5: 1）吸收， 4C, 30-60min后，加入不完全培养基 RPMI 1640中，制备成含20%、牛血清的 完全培养基。543.3 补体制备 股动脉取血，静置 30-60min , 2500rpm/min, 15min分离血清，将5

32、-10只豚鼠血清混合后，与压积 SRBC以 5: 1 (v/v )比例混合，4C 冰箱放置30-60min，间或震荡，2500rpm/min，15min分离血清，分装，-80 C冰 箱保存。用时以完全培养基1: 10 (v/v )比例稀释。5.4.3.4 免疫动物压积SRBC以生理盐水制成2% (v/v )的细胞悬液(约1 X 108个SRBC，每只鼠腹腔注射0.2mL。5.4.3.5 脾细胞悬液制备 将SRBC免疫4-5天后的小鼠颈椎脱臼处死，无菌 取脾脏，并在脾上面放置一块纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个 细胞悬液，200目筛网过滤，1000rpm/min，10min,去上清，

33、Hank液洗2遍， 以完全培养基RPMI 1640制备成5X 1061 X 107个细胞/mL的脾细胞悬液。5.4.3.6 空斑的测定5.4.3.6.1 底层培养基制备0.5g琼脂糖加入100mL灭菌生理盐水中，加热溶解， 待温度于50C左右时，以1mL/孔的量加至六孔培养板中，琼脂凝固后备用。5.4.3.6.2 顶层培养基制备 0.5g 琼脂糖加入100mLHank s液中(PH7.2-7.4 ), 加热溶解，以0.5mL/试管的量加至46-50 C恒温的试管中。5.4.3.6.3 铺板：50 y20%SRB(生理盐水配制，v/v )、200卩1脾细胞悬液先 后加入含有0.5mL顶层的试管中

34、，迅速混匀，倒入六孔板中并铺平顶层混合液， 每个样本做两个平行孔。5.4.3.6.4 空斑测定：已制备好培养板放入 37C、5%CO2培养箱中孵育1h,然后每孔加入500卩以完全培养基稀释的补体(v/v，1: 10)，继续孵育2h，自动 图象分析仪读取溶血空斑图象分析软件计数溶血空斑数。取平行孔空斑数的平均值为样本的溶血空斑数值，以空斑数/106脾细胞表示。5.4.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F0.05,P 0.05, 用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计

35、；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进 行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用空斑数/106脾细胞或空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。5.5血清溶血素的测定可任选下列方法之一。5.5.1 血凝法5.5.1.1 原理用SRBC免疫动物后，产生抗SRB(抗体(溶血素)，利用其凝集SRBC的程度 来检测溶血素的水平。5.5.1.2 仪器和材料SRBC、生理盐水、微量血凝实验板、离心机5.5.1.3 实验步骤5.5.1.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有

36、玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4C冰箱保存备用，可保存2周。5.5.1.3.2 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤 3次，每次离心 (2000r/min)10min。将压积SRB(用生理盐水配成2%(v/v )的细胞悬液，每只 鼠腹腔注射0.2ml进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h， 将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出， 2000r/min离心10min,收集血清。5.5.1.3.3 凝集反应 用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置 于微量血凝实验板内，每孔100卩，再加入100 10.5 % (v/v)的SRBCt液，混 匀，

37、装入湿润的平盘内加盖，于 37C温箱孵育3h,观察血球凝集程度。5.5.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fq.q5,结论：各组均数间差异无显著性；F值Fo.5,P Na（O0.3g, 加蒸馏水至 1000mL、 都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL5.5.2.3 实验步骤5.5.2.3.1 SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4C冰箱保存备用，可保存2周。5.5.2.3.2 制备补体采集豚鼠血，分离出血清（至少 5

38、只豚鼠的混合血清）， 将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4C冰箱30min,经常振荡，离心取 上清，分装，70C保存。用时以SA缓冲液按1 : 8稀释。5.5.2.3.3 免疫动物及血清分离 取羊血，用生理盐水洗涤 3次，每次离心 （2000r/min）10min。将压积SRB（用生理盐水配成2%（v/v、的细胞悬液，每只 鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h， 使血清充分析出，2000r/min离心10min，或6000r/min,4min,收集血清。5.5.2.3.4 溶血反应测定5.52341检测方法1 （分光光度计测定）：取血清用SA

39、缓冲液稀释（一般为200500倍）。将稀释后的血清1mL置试 管内，依次加入10%（v/v）SRBC 0.5mL，补体1mL（用 SA液按1:8稀释）。另设 不加血清的对照管（以SA液代替）。置37C恒温水浴中保温1530min后，冰 浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL加都氏试剂3mL同时取 10% （v/v）SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL充分混匀，放置10min后，于540nm 处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。5.5.2.3.4.2 检测方法2（全自动酶标仪测定）：设样品孔和空白对照孔，样品孔：取血清 10卩,1用1mL1:5稀释的SA缓冲液 稀释

40、；每孔加入稀释后的血清 100卩;1空白对照孔：每孔加入10011:5稀释的 SA缓冲液，再依次加入10% （v/v）SRBC 50卩,1补体100卩1（用SA溶液或PBS溶 液按1:8稀释），置37E恒温水浴中保温30min, 1500r/min离心10min。然后样 品孔和空白对照孔各取上清液50 1加入另一个96孔培养板内，加都氏试剂150诃 同时设半数溶血孔，加入10%（v/v）SRBC 12.5卩,1再加都氏试剂至200卩。 用震荡器充分混匀，放置10min后，于540nm处用全自动酶标仪测定各孔光密度 值。5.5.2.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进

41、行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fq.q5,结论：各组均数间差异无显著性；F值Fq.q5,P 0.05,用 多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。溶血素的量以半数溶血值（HG）表示，按下列公式计算：样品光密度值样品HGo=x稀释倍数SRBC半数溶血时的光密度值样品光密度值-空白光密度值或样品HGo=x稀释倍数SRBC半数溶血时的光密度值-空白光密度值受试样品组的HCo显著高于对照组的HCo,可判定该项实验结果阳性。

42、5.6小鼠碳廓清实验5.6.1 原理在一定范围内，碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵座标，时间为横座标，两者呈直线关系。此直线斜率 （K） 可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数a表示。5.6.2仪器和试剂分光光度计、全自动酶标仪、计时器、血色素吸管、印度墨汁、 NaCO5.6.3实验步骤5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁 将印度墨汁原液用生理盐水稀释 34倍。Na 2CO溶液 取O.IgNazCO,加蒸馏水至100mL5.6.3.2 注射墨汁 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁， 按每10g体重O.ImL计算。待墨汁注入，立即计时。5.6.

43、3.3 测定注入墨汁后2、10min,分别从内眦静脉丛取血20卩1,并立即将其加到2mL0.1%NaCO溶液中。用分光光度计或全自动酶标仪在600nm波长处测光密度值（OD，以NaCO溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a:lgOD i-lgOD2体重吞噬指数 a=肝重+脾重5.6.4数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值 F0.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值F.05,P Ig-Li-S-i-e-R2W10FL2-HoO *O! gFSC-

44、SSC和FL2-SSC二维散点图R110 0.00289.75R265.70261.77R319.39319.14R48.84363.63R54.10410.94R61.12441.94Re gio n % Gated 丫 Mean图2吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞R1:总巨噬细胞群R2:未吞噬荧光微球的巨噬细胞群R3:吞噬一个荧光微球的巨噬细胞群R4：吞噬两个光微球的巨噬细胞群R5:吞噬三个荧光微球的巨噬细胞群R6:吞噬四个或四个以上荧光微球的巨噬细胞群Marker% GatedMedianAll100.002.33M165.651.70M219.56691.58M38.911240.94

45、M44.051700.08M51.052287.572-H I 02 .1 L图3吞噬荧光微球后的小鼠腹腔巨噬细胞FL2直方图5.7.4数据处理及结果判定吞噬荧光微球的巨噬细胞数吞噬百分率（%） = X 100计数的巨噬细胞数被吞噬的荧光微球总数吞噬指数=计数的巨噬细胞数以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。吞噬百分率需进行 数据转换，x= Sin -1p，式中P为吞噬百分率，用小数表示，然后再进行方差 分析，在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐， 计算F值，F值 Fo.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值Fo.o5,p 0.05,用 多个实验组和一个

46、对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行 统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较， 差异均有显著性，可判定该项实验结果阳性。5.7.5 注意事项5.7.5.1 颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管破裂出血，导致腹腔 洗液中混杂大量红细胞，影响流式细胞仪的结果分析。5.7.5.2 孵育、细胞洗涤和上机全程注意避光，以保持微球荧光稳定性。5.7.5.3 巨噬细胞、荧光微球浓度要根据试剂说明书调整合适，否则影响结果 准

47、确性。5.7.5.4 细胞处理过程要轻柔，尽量减少碎片和杂质对结果分析的影响。5.7.5.5 腹水细胞上机前一定要用足够标准的滤器过滤，调理后多余的荧光微 球要尽量去除，以防止流式细胞仪堵塞。5.8 NK细胞活性测定NK细胞是没有T和B细胞表面标志的淋巴细胞，具有非特异性杀伤作用可任选下列方法之一测定。5.8.1乳酸脱氢酶（LDH测定法581.1 原理正常情况下，活细胞的胞浆内含有的 LDH不能透过细胞膜，当细胞受到 NK 细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH 后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐 （PM$还原碘硝基氯化四氮唑（INT）, INT接 受J

48、被还原成紫红色甲月赞类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。5.8.1.2 仪器和材料酶标仪、全自动细胞计数仪、YAC-1细胞、Hanks液（pH7.27.4 ）、RPMI1640完全培养液、乳酸锂或乳酸钠、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS、NAD 0.2mol/L 的 Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）、1% NP40或 2.5%Triton5.8.1.3 实验步骤5.8.1.3.1 LDH 基质液的配制乳酸锂 5 x 10- mol/L硝基氯化四氮唑（INT） 6.6 x 10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS 2.8 x 10-4mol/L氧化型辅酶1（ NA

49、D 1.3 x 10-3mol/L将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液中（pH8.2）5.8.1.3.2 靶细胞的传代（YAC-1细胞）实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为4x 105个/mL05.8.1.3.3 脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hanks液的小平皿中，并在脾上面放置一块 纱布，用大号注射器内芯轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤， 用Hanks液洗2次，每次离心10min （1000r/min ） 弃上清将细胞浆弹起，加 入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入 0.5mL2倍Hank s液及8mLHank s 液，1