课题3血红蛋白的提取和分3离课件

1、课题3血红蛋白的提取和分3离1 课题3血红蛋白的提取和分3离2 课题3血红蛋白的提取和分3离3 凝胶色谱法凝胶色谱法 1 1、凝胶：、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的 通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2 2、概念：、概念： 也称（也称（分配色谱法分配色谱法）根据相对分子质量）根据相对分子质量 的大小分离蛋白质的有效方法的大小分离蛋白质的有效方法 3 3、原理：、原理： 课题3血红蛋白的提取和分3离4 分子量分子量大大小小 直径大小直径大小 大于大于凝胶颗粒空凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡隙直径，被阻挡 在颗粒的外

2、面在颗粒的外面 小于小于凝胶颗粒空凝胶颗粒空 隙直径，可以进隙直径，可以进 入颗粒内部入颗粒内部 运动方式运动方式垂直向下移动垂直向下移动 垂直向下移动，垂直向下移动， 无规则扩散进入无规则扩散进入 颗粒内部颗粒内部 运动速度运动速度较快较快较慢较慢 运动路径运动路径较短较短较长较长 洗脱次序洗脱次序 先从先从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱 出来出来 后从后从凝胶柱洗脱凝胶柱洗脱 出来出来 课题3血红蛋白的提取和分3离5 4 4、具体过程、具体过程 课题3血红蛋白的提取和分3离6 课题3血红蛋白的提取和分3离7 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分用凝胶色谱法分离蛋白质时，分 子量大的蛋白质子量大的蛋白质 A

3、A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快 D 课题3血红蛋白的提取和分3离8 相对分子质量不同的蛋白质在凝相对分子质量不同的蛋白质在凝 胶中的进行过程可表示为图中哪一个胶中的进行过程可表示为图中哪一个 B 课题3血红蛋白的提取和分3离9 1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在一定的范围内，能对抗外来少 量量强酸、强碱强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液或稍加稀释不引起溶液PHPH发发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显

4、变化的作用叫做缓冲作用，具有缓 冲作用的溶液叫做缓冲溶液冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：缓冲溶液： 2 2、作用：、作用： 能够抵制（能够抵制（ ）对溶）对溶 液（液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不基本不 变。变。 外界的酸或碱外界的酸或碱 pHpH值值 课题3血红蛋白的提取和分3离10 3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中 配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（就可以制得（ ） 使用的缓冲液。使用的缓冲液。 1 12 2 使用比例使用比例 在不同在不同PHPH范围内范围内 思考：说出

5、人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 磷酸缓冲液磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和，保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察功能，便于观察()和科学研究其和科学研究其() 4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？ 课题3血红蛋白的提取和分3离11 （三）（三） 电泳：电泳： 带电粒子带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等 都具有可解离的基团，在一定的都具有可解离的基团，在一定的PHPH下，这些基下，这些基

6、 团会带上团会带上正电或负电正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带其所带电荷相反的电荷相反的电极移动。电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种分子带电性分子带电性 质的差异以及分子本身的大小，形状的不同质的差异以及分子本身的大小，形状的不同， 使带电分子产生不同的使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实现样，从而实现样 品中各种分子的品中各种分子的分离分离。 课题3血红蛋白的提取和分3离12 影响蛋白质分子运动速度的因素影响蛋白质分子运动速度的因素 决定决定 运动方向运动方向 形成形成 库仑力库仑力 形成形成

7、阻力阻力 决定决定 运动速率运动速率 电荷性质电荷性质 电荷量电荷量 分子形状分子形状 分子大小 琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳 聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳凝胶电泳 课题3血红蛋白的提取和分3离13 在电场的作用下，这些带电分子会向着在电场的作用下，这些带电分子会向着 与其所带电荷相反的电极移动与其所带电荷相反的电极移动 课题3血红蛋白的提取和分3离14 （1 1）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移迁移 率率取决于它所带取决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子分子 的大小的大小等因素等因素。 为了消除为了消除净电荷对迁移率的影

8、响净电荷对迁移率的影响，可，可 以在凝胶中加入以在凝胶中加入SDSSDS。 （2 2）原理：）原理： 课题3血红蛋白的提取和分3离15 SDS SDS能使蛋白质发生完全能使蛋白质发生完全变性。变性。由几条由几条 肽链组成的肽链组成的蛋白质复合体蛋白质复合体在在SDSSDS的作用下会的作用下会 ，因此测定的结果只是，因此测定的结果只是 。SDSSDS能与各种蛋白质形成能与各种蛋白质形成 ，SDSSDS所带负电荷的量所带负电荷的量 大大超过了蛋白质分子大大超过了蛋白质分子。因而因而 掩盖了掩盖了，使电，使电 泳迁移率完全取决于泳迁移率完全取决于分子的大小分子的大小。 作用机理作用机理: : （2

9、2）聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳 课题3血红蛋白的提取和分3离16 一般分为四步：一般分为四步： （1）样品处理样品处理：包括洗涤红细胞；血红：包括洗涤红细胞；血红 蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋 白溶液。白溶液。 （2）粗分离粗分离：透析除去分子较小的杂质。：透析除去分子较小的杂质。 （3）纯化：纯化：通过凝胶色谱法将分子量较通过凝胶色谱法将分子量较 大的杂质蛋白质除去。大的杂质蛋白质除去。 （4）纯度鉴定纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电：通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳鉴定。泳鉴定。 二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化 纯度

10、鉴定纯度鉴定 课题3血红蛋白的提取和分3离17 二、实验操作：二、实验操作： 知识回顾知识回顾 课题3血红蛋白的提取和分3离18 （一）样品处理（一）样品处理 1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤： 2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放： 3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液： 4 4、透析、透析 二、实验操作：二、实验操作： 课题3血红蛋白的提取和分3离19 分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层 脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层 血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体 红细胞破碎物沉淀红细胞破碎

11、物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物 课题3血红蛋白的提取和分3离20 课题3血红蛋白的提取和分3离21 3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不 同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小 C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异 4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固 课题3血红蛋白的提取和分3离22 1 1、凝胶色谱柱

12、的制作：、凝胶色谱柱的制作： 制作过程：准备材料制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装安装 色谱柱色谱柱 课题3血红蛋白的提取和分3离23 步骤步骤操作要求操作要求 操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上 计算称量凝计算称量凝 胶胶 根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量 配制悬浮液配制悬浮液 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀 凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 装填悬浮液装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打 缓冲液洗涤缓冲液洗涤 平衡平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h 课题3血红蛋

13、白的提取和分3离24 装配好的凝胶柱 课题3血红蛋白的提取和分3离25 课题3血红蛋白的提取和分3离26 正确的加样操作是正确的加样操作是 （1 1）不要触及并破坏凝胶面。不要触及并破坏凝胶面。 （2 2）贴壁加样。）贴壁加样。 （3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动。）使吸管管口沿管壁环绕移动。 课题3血红蛋白的提取和分3离27 收集得到的纯化后的蛋白 课题3血红蛋白的提取和分3离28 下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操 作，其中正确的是（作，其中正确的是（ ） A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤

14、红细胞 C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流 出液出液 A 课题3血红蛋白的提取和分3离29 让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内，维持结构和范围内，维持结构和 功能正常。功能正常。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以 通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血 红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 课题3血红蛋白

15、的提取和分3离30 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大血红蛋白提取和分离的程序可分为四大 步，包括：步，包括： 。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释 放、离心等操作收集到放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即: :样样 品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂 质，即样品的粗分离；然后质，即样品的粗分离；然后 将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即: :样样 品的纯化；最后经品的纯化；最后经进行进行 纯度鉴定。纯度鉴定。 课题3血红蛋白的提取和分3离31 鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。 血 红 蛋 白 的 取 和 分分 离 凝胶色谱法 原理分离过程 凝胶电泳法 缓冲