酶工程实验生物工程课件

1、本实验共有六个分实验本实验共有六个分实验 : : 实验一实验一 酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定 实验二实验二 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度 实验三实验三 酵母蔗糖酶的结晶（选做）酵母蔗糖酶的结晶（选做） 实验四实验四 蔗糖酶酶学性质的研究蔗糖酶酶学性质的研究 实验五实验五 酵母蔗糖酶的固定化酵母蔗糖酶的固定化 实验六实验六 酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰 细胞膜内侧细细胞膜内侧细 胞质，含有少胞质，含有少 量的糖。量的糖。 外蔗糖酶外蔗糖酶 内蔗糖酶内蔗糖酶 细胞膜的外侧，占细胞膜的外侧，占 蔗糖酶

2、活力的大部蔗糖酶活力的大部 分，是含有分，是含有50% 50% 糖糖 成分的糖蛋白。成分的糖蛋白。 由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、 加热除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步 骤，分离纯化酵母蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶 电泳对其纯度进行初步检验。 有机溶剂分级的原理：有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有有机溶剂分级的原理：有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有 机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是：其原理是：

3、1 1、有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引、有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子上不同电荷的引 力，使蛋白质溶解度下降；力，使蛋白质溶解度下降； 2 2、有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质的溶解度下、有机溶剂与水作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质的溶解度下 降。降。 结合力的大小取决于彼此之间相反电荷 基团的静电引力 静电引力大小与溶液的pH值有关，因pH 值决定蛋白质的解离程度。 NH3R COOH + NH3R COO + - RNH2 COO- Low pH Positive charge High pH Negative charge H

4、ydrogen gained Hydrogen lost 阳离子交换剂 样品溶液pHpI时，酶带正电荷； 阴离子交换剂 样品溶液pHpI时，酶带负电荷 一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上 样品溶液的pH与酶pI相差越大的，带电 荷越多 通过逐渐增加洗脱液离子强度的 梯度洗脱方式，可使结合在层析柱上的蛋 白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗 出层析柱。 Sample application andwash ElutionEquilibrationRegeneration - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

5、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + anion exchanger bead - - - - - - - - - - 本实验中使用的本实验中使用的DEAE-DEAE- 5252是弱碱性的是弱碱性的阴离子阴离子纤维纤维 素，其基本骨架是纤维素素，其基本骨架是纤维素 、活性基团为、活性基团为二乙基氨乙二乙基氨乙 基（基（DEAEDEAE）。该纤维素的。该纤维素的 吸附

6、量大，分辨率高，化吸附量大，分辨率高，化 学性质稳定。学性质稳定。 控制：样品溶液pHpI时，酶带负电荷 离子交换柱层析的原理：离子交换柱层析的原理： 根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术在分离根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术在分离 过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤过程中，以离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中，离子交换纤 维素的优点是：维素的优点是： 1 1、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大；、开放性的长链结构、较大的表面积，所以对蛋白质吸附容量大； 2 2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白

7、质的吸附不是太牢固、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固 ，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变，所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的，不致引起蛋白质变 3 3、用其装好的层析柱在较广的、用其装好的层析柱在较广的pHpH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变和盐浓度范围内都不会发生体积的改变 ，所以有利于蛋白质层析。，所以有利于蛋白质层析。 本实验中使用的本实验中使用的DEAE-52DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为 二乙基氨乙基（二乙基氨乙基（DEAEDEAE）。该纤

8、维素的吸附量。该纤维素的吸附量 大，分辨率高，化学性质稳定。大，分辨率高，化学性质稳定。 为了确定哪个峰是含目标酶，要进行酶 活力的测定； 用蔗糖做底物反应一段时间后， 检测生成的葡萄糖的量；用尿糖试纸初步检 测；用DNS法精确检测。 Sucrase（蔗糖酶） glucosefructoseSucrose Semi-quantitativeassayofyeastsucrase activitywithU-Glutest-tape Sucrose glucoseoxidase（葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶） gluconicacidH2O2 （葡萄糖酸（葡萄糖酸） H2O+O2- coloured

9、substance Sucrase（蔗糖酶） glucosefructose Hydrogen peroxidase（过氧化过氧化 氢酶）氢酶） colourlesssubstance （无色物质）（无色物质） U-Glu test-tape 尿糖试纸 黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件 下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成 正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。 酶活定义： 在37 ，Ph4.5，每分钟催化蔗糖生 成1M葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。 管号管号 操作操作 空白空白标准葡萄

10、糖浓度梯度标准葡萄糖浓度梯度样品样品 012345AB 葡萄糖标准葡萄糖标准 液液mg/mlmg/ml 0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0 蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 醋酸醋酸bufferbuffer1 11 11 11 11 11 11 11 1 待测酶液待测酶液0 00 00 00 00 00 0200微微 升升 200微微 升升 3737准确反应准确反应10 min10 min，1 mL 1 mol/L NaOH1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应终止酶促反应 水杨酸试剂水杨酸试剂 （DNSDNS） 1

11、ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml 沸水浴精确反应沸水浴精确反应5 min,5 min,冷却后定容至冷却后定容至20 mL20 mL A540 为了确定获得的目标酶纯不纯，要进行 SDS-PAGE电泳检测； 1.1.破碎细胞破碎细胞 取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于 预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨 30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上 刚出现冰结为宜），重复2次。将研磨液转移 至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃 去沉淀。留0.5 mL上清液为第一组分。 2.2.加热除杂蛋白加热除

12、杂蛋白 将上清液转入三角瓶，用1 mol/L 醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后 迅速放入50的水浴中，保温30 min。在 温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。之 后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的 转速离心20 min，弃去沉淀。留0.5 mL上 清液为第二组分。 3.3.乙醇沉淀乙醇沉淀 量出上清液的体积，加入等体积 的95%冷乙醇溶液(预先放在-20低温下的 时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。将沉淀 溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液 (pH

13、值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全 溶解，以12000 r/min的转速离心25 min， 取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部 分(乙醇抽提液)进行第4步操作。 4 4. .上柱上柱 装DEAE-Sepharose Fast Flow离子 交换柱层析，用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲 液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱，上 样后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值 7.3)平衡，然后用0.05 mol/L Tris-HCl缓 冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3) 进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0-0.5 mol/

14、L)洗脱。 层析柱连上梯度混合器，混合器分别 装30 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3) 和30 mL含有0.5 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris- HCl缓冲液(pH值7.3)，每1 min收集1管。洗脱至 混合器中液体流完为止，测定各接收管在280 nm 下的光吸收值，并用尿糖试纸半定量测定各管的 酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作为第四组分 用于纯度测定。 5.用尿糖试纸进行半定量测定： 在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液 ，再加3滴含10蔗糖的pH 4.5的醋酸缓冲 液，搅匀，37放置10 min，浸入尿糖试 纸，1 s后取出，60 s

15、后比较颜色的深浅， 与比色卡对照。 管号管号 操作操作 空空 白白 标准葡萄糖浓度梯度标准葡萄糖浓度梯度样品样品 012345AB 葡萄糖标准葡萄糖标准 液液mg/mlmg/ml 0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0 蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 醋酸醋酸bufferbuffer1 11 11 11 11 11 11 11 1 待测酶液待测酶液0 00 00 00 00 00 0100微微 升升 100微微 升升 3737准确反应准确反应10 min10 min，1 mL 1 mol/L NaOH1 mL 1 mol/L

16、NaOH终止酶促反应终止酶促反应 水杨酸试剂水杨酸试剂 （DNSDNS） 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1m l l 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml 沸水浴精确反应沸水浴精确反应5 min,5 min,冷却后定容至冷却后定容至20 mL20 mL A540 葡萄糖标准液配制（葡萄糖标准液配制（1mg/ml1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置：预先将分析纯葡萄糖置 8080烘箱内约烘箱内约1212小时。准确称取小时。准确称取500mg500mg葡萄糖于烧杯中，葡萄糖于烧杯中， 用蒸馏水溶解后，移至用蒸馏水溶解后，移至500ml500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰容量瓶中

17、，定容，摇匀（冰 箱中箱中44保存期约一星期）。保存期约一星期）。 醋酸醋酸buffer(0.2mol/L)buffer(0.2mol/L)称取称取3.28g3.28g无水乙酸钠，溶解于无水乙酸钠，溶解于 150ml150ml蒸馏水，用冰乙酸调节其蒸馏水，用冰乙酸调节其phph至至4.54.5，然后定溶至，然后定溶至 200mL200mL。 10%10%蔗糖溶液：蔗糖溶液：10g10g蔗糖溶解于蔗糖溶解于醋酸醋酸buffer(0.2mol/L)buffer(0.2mol/L) 中，定容至中，定容至100ml100ml 1mol/L NaoH1mol/L NaoH溶液：溶液：4gNaoH4gNa

18、oH溶解于溶解于100ml100ml蒸馏水中蒸馏水中 四、结果分析四、结果分析 以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、 酶活、NaCl浓度为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图 。 五 思考题： 离子交换纤维素层析的优点有哪些？ 有机溶剂抽提蛋白质的原理是什么？ Review Total activity Specific activityhow to calculate it, what it means, how it changes during a purification Fold purificationwhat it is, how to calculate it Yield

19、what it is, how to calculate it, how it changes during a purification 1 1：回收率是纯化后的总活力除以纯化前的总：回收率是纯化后的总活力除以纯化前的总 活力活力 2 2： 纯化倍数是纯化后的比活力除以纯化前纯化倍数是纯化后的比活力除以纯化前 的比活力（第一次的比活力）的比活力（第一次的比活力） 注：比活力：比活力活力单位数注：比活力：比活力活力单位数mgmg蛋白蛋白 （1 1）丙烯酰胺和）丙烯酰胺和N, N-N, N-亚甲双丙烯酰胺。亚甲双丙烯酰胺。 以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离子水配以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去

20、离子水配 制含有制含有29%29%（w/vw/v）丙烯酰胺和）丙烯酰胺和1%1%（w/vw/v）N, N, N-N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液亚甲双丙烯酰胺的贮存液 。 （2）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液）： 1.5M Tris-HCl，0.4% SDS （3）0.5M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液）： 0.5M Tris-HCl，0.4% SDS （4）10%过硫酸铵 以上先配！ 等待凝胶聚合时再配！ （8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液(pH 8.3)： 0.025M Tris，0.192M 甘氨酸，0.1% SDS （9）样品处理液：50mM Tris-HCl(pH 6.8

21、)， 100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油 （10）染色液：0.1% 考马斯亮蓝 R250，40% 甲醇，10% 冰醋酸 （11）脱色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸 （1 1）根据厂家说明书安装玻璃板）根据厂家说明书安装玻璃板 （2 2）确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的）确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的 数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配制 一定体积的分离胶溶液。一旦加入一定体积的分离胶溶液。一旦加入TEMEDTEMED， 马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并

22、 进入下步操作。进入下步操作。 （3 3）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液）迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液, , 留出灌注浓缩胶所需空间留出灌注浓缩胶所需空间( (梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5cm)0.5cm)。 再在胶液面上小心注入一层水（约再在胶液面上小心注入一层水（约23mm23mm高），以阻高），以阻 止氧气进入凝胶溶液。止氧气进入凝胶溶液。 （4 4）分离胶聚合完全后（约）分离胶聚合完全后（约3030分钟），倾出覆盖水分钟），倾出覆盖水 层，再用滤纸吸净残留水。层，再用滤纸吸净残留水。 （5）制备浓缩胶：按下表给出的数据， 在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度 的

23、丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，马上开 始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入 下步操作。 （6）聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即 在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避 免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳 子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下 。 （7）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处 理，在样品中按1:1体积比加入样品处理液 ，在100加热3分钟以使蛋白质变性。 （8）浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移 出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下 槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设 法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。 将100ul蛋白样品与100ul样品处理液混合 均匀，然后将此混

24、合液在100摄氏度中水浴 10min，冷却至室温后，12000rpm离心10分 钟，即做成电泳样品。 （1）按予定顺序加样，加样量通常为10 25l（1.5mm厚的胶）。 （2）将电泳装置与电源相接，凝胶上所 加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶 后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直 至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然 后关闭电源。 （3 3）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开 玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶 下部切去一角以标注凝胶的方位。下部切去一角以标注凝胶的方位。 经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋

25、白质 样品可用考马斯亮蓝R250染色。染色12小时 或过夜。 需需3 31010小时，其间更换多次脱色液至背景清小时，其间更换多次脱色液至背景清 楚楚 脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料 袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对袋内而不降低染色强度。为永久性记录，可对 凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。此方法凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。此方法 检测灵敏度为检测灵敏度为0.20.21.0g1.0g。 观察并记录实验结果，判断酶的观察并记录实验结果，判断酶的 纯度，拍出电泳酶纯度的检验结果。纯度，拍出电泳酶纯度的检验结果。 一、原理一、原理 将含

26、有一定盐浓度的缓冲液与含有低于这种盐浓度的 蛋白质混合溶液在一个密封体系内一起蒸发扩散，最后 达到平衡，使蛋白质溶液内盐浓度提高，而pH值接近待 结晶蛋白质等电点的缓冲液又使中性盐对蛋白质的盐析 作用更为显著，因此导致蛋白质溶解度降低，溶液逐渐 达到过饱和而析出结晶。 1.1.用用“吹气法吹气法”除去酒精泡洗后的除去酒精泡洗后的2424孔组织孔组织 培养板和盖玻片上可能带有的灰尘，以防培养板和盖玻片上可能带有的灰尘，以防 形成不必要的成核中心而影响晶体的观察形成不必要的成核中心而影响晶体的观察 。 2.在24孔组织培养板的某孔中加入1 mL 含0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液（pH 6

27、.5 ）作为池液,孔边缘均匀涂抹上高真空油脂 ，勿使其进入孔内。 3.吸取1 L待结晶酶蛋白溶液置盖玻片中央 , 加等体积池液至此液滴中，用枪头轻轻地 的吹吸液滴以保证混合液的均匀性并避免气 泡出现。 4.小心、迅速地翻转盖玻片并盖在培养板的 孔上, 旋转45度以保证密封良好。 5.室温下静置状态培养一周以上。 三、实验结果三、实验结果 一周后于体视镜下观察酵母蔗糖酶的一周后于体视镜下观察酵母蔗糖酶的 晶体结构。晶体结构。 酶学性质的研究酶学性质的研究包括：最适温度、 最适pH、米氏常数、激活剂、抑制剂等。 一般通过单因素实验确定。 配如下溶液： 0.2mol/L磷酸氢二钠 0.2mol/L乙

28、酸钠 0.2mol/L柠檬酸 0.2mol/L乙酸 0.2mol/L磷酸二氢钠 1、最适pH的测定 （1）按下表配制缓冲溶液 将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其 溶液pH值以酸度计测量值为准。 溶液溶液pH 缓冲试剂缓冲试剂体积体积ml 缓冲试剂缓冲试剂体积体积ml 2.50.2mol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠 2.000.2mol/L柠檬酸柠檬酸 8.00 3.00.2mol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠 3.650.2mol/L柠檬酸柠檬酸 6.35 4.00.2mol/L乙酸钠乙酸钠 1.800.2mol/L乙酸乙酸 8.20 5.00.2mol/L乙酸钠乙酸钠 7.000.2mol/L

29、乙酸乙酸 3.00 6.00.2mol/L乙酸钠乙酸钠 9.500.2mol/L乙酸乙酸 0.50 7.00.2mol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠 6.100.2mol/L磷酸二氢钠磷酸二氢钠 3.90 8.00.2mol/L磷酸氢二钠磷酸氢二钠 9.50.2mol/L磷酸二氢钠磷酸二氢钠 0.5 （2） 准备二组各7支试管，第一组7支试管 每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然 后加入一定量的蔗糖酶。另一组7支试管也 是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液， 但不再加酶而加入等量的去离子水，分别 作为测定时的空白对照管。所有的试管都 用水补足到0.8ml。 比色管号1234567 蔗糖溶液

30、00.10.20.40.81.62 ddH2O21.91.81.61.20.40 醋酸buffer1111111 游离酶1111111 37准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应 水杨酸试剂1111111 沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至20 mL A540 管号管号 操作操作 空空 白白 标准葡萄糖浓度梯度标准葡萄糖浓度梯度样品样品 012345AB 葡萄糖标准液葡萄糖标准液 mg/mlmg/ml 0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0 蔗糖溶液蔗糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 各种各种phph缓冲

31、液缓冲液1 11 11 11 11 11 11 11 1 待测酶液待测酶液0 00 00 00 00 00 0100微微 升升 100微微 升升 3737准确反应准确反应10 min10 min，1 mL 1 mol/L NaOH1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应终止酶促反应 水杨酸试剂（水杨酸试剂（ DNSDNS） 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1m l l 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml 沸水浴精确反应沸水浴精确反应5 min,5 min,冷却后定容至冷却后定容至20 mL20 mL A540 （3） 所有的试管按一定时间间隔加入 0.2ml蔗糖（0

32、.2mol/L)开始反应，反应 10min后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止 酶促反应，加水杨酸试剂1ml，沸水浴精确 反应5 min,冷却后定容至20 mL，然后测定 A540的吸光值。 2、最适温度的测定 测定室温、30、40、50、 60、70、80、 90不同温度下蔗糖 酶催化和酸催化的反应速度。 每个温度准备1支试管，以乙酸缓冲 液作为缓冲液。 管号管号 操作操作 空空 白白 标准葡萄糖浓度梯度标准葡萄糖浓度梯度样品样品 012345AB 葡萄糖标准液葡萄糖标准液 mg/mlmg/ml 0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 10 00 0 蔗糖溶液蔗

33、糖溶液1 11 11 11 11 11 11 11 1 醋酸缓冲液醋酸缓冲液 ph4.5ph4.5 1 11 11 11 11 11 11 11 1 待测酶液待测酶液0 00 00 00 00 00 0100微微 升升 100微微 升升 各个温度环境下准确反应各个温度环境下准确反应10 min10 min，1 mL 1 mol/L NaOH1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应终止酶促反应 水杨酸试剂（水杨酸试剂（ DNSDNS） 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1m1m l l 1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml 沸水浴精确反应沸水浴精确反应5 min,5 min,

34、冷却后定容至冷却后定容至20 mL20 mL A540 （1） 确定酶的稀释倍数，试管中加入 0.2ml 0.2mol/L pH4.5的乙酸缓冲液，0.2ml 稀释的酶，加水至0.8ml 加入1ml 10%的蔗糖 开始计时，在室温下反应10min，后分别加入 1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸 试剂1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容 至25 mL，然后测定A540的吸光值。 须得到 0.20.3A的吸光度，准备一个水的空白对照 管用于测定所有的样品管。 （2）测定上列各个温度下的反应 速度，每次用1支试管，均加入0.2ml乙酸 缓冲液均用水调至0.8ml，放入水

35、浴温度下 使反应物平衡30秒，加入10%蔗糖0.2ml， 准确反应10分钟，后分别加入1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应，加水杨酸试剂 1ml，沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至 25 mL，然后测定A540的吸光值。记录每个 水浴的准确温度。 （3） 酶催化的各管A540 值均进行酸催 化的校正。画出酶催化的反应速度对温度 的关系曲线。 比色管号比色管号1234567 蔗糖溶液蔗糖溶液mL 1 111111 醋酸醋酸buffer mL 1111111 无水乙醇无水乙醇mL 00.10.20.40.81.62 ddH2O mL21.91.81.61.20.40 乙醇终浓度乙醇终

36、浓度02.5%5%10%20%40%50% 酶酶mL0111111 37准确反应准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应终止酶促反应 水杨酸试剂水杨酸试剂 mL 1111111 沸水浴精确反应沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至冷却后定容至25 mL A540 比色管号1234567 蔗糖溶液00.10.20.40.81.62 ddH2O21.91.81.61.20.40 醋酸buffer1111111 游离酶1111111 37准确反应10 min，1 mL 1 mol/L NaOH终止酶促反应 水杨酸试剂1111111 沸水浴精确反应5 min,冷却后定容至2

37、0 mL A540 1. 画出蔗糖酶活性与pH的关系曲线。 2.画出酶催化的反应速度对温度的关系曲线。 3.画出乙醇对酶催化的反应速度影响的曲线。 4.采用双倒数作图法得出蔗糖酶的Km值。 本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖 酶属共价偶联法。 为了评价固定化方法的好坏，需 进行酶回收率和酶相对活力的计算。 1.1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联 （1）称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌 均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠 状； （2）称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸 馏水及20 mL甲醇。 （3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上 ，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶 液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中， 以制备壳聚糖微球载体。 （4）壳聚糖溶液滴加完毕后，静止片刻， 待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多 次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛 溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳 聚糖载体上。 2.2.固定化酶