第三章 免疫酶组织化学技术

1、第三章第三章 免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术 酶酶-辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶 酶标记已知酶标记已知Ab(Ab(或或Ag) + Ag) + 组织细胞内相应的组织细胞内相应的Ag(Ag(或或Ab)Ab) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物( (酶标酶标) ) 底物底物 有色沉淀有色沉淀 定位；定位； 图像分析仪半定量图像分析仪半定量 免疫组化方法免疫组化方法 v酶标抗体免疫组织化学酶标抗体免疫组织化学 直接法直接法 间接法间接法 v非酶标抗体免疫组织化学非酶标抗体免疫组织化学 酶桥法酶桥法 PAPPAP法、法、APAAPAPAAP法

2、法 一、酶标抗体免疫组织化学染色法一、酶标抗体免疫组织化学染色法 （一）原理（一）原理 直接法和间接法。直接法和间接法。 直接法直接法- 是将酶标记在第一抗体上是将酶标记在第一抗体上, ,直接检测细胞内特异性抗原。直接检测细胞内特异性抗原。 间接法间接法-两步法两步法 一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体；一抗：是细胞组织内抗原的特异性抗体； 二抗：是抗一抗的抗体二抗：是抗一抗的抗体, ,并且已用酶标记。并且已用酶标记。 ( (注意注意: :第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的, ,因因 为第二抗体往往是用第一种动物的为第二抗体往往是用第一种动物的Ig

3、GIgG所制备。所制备。) ) 原理：原理：将酶直接标记在一抗上，将酶直接标记在一抗上， 然后直接与相应抗原特异地结合。然后直接与相应抗原特异地结合。 形成形成复合物，最后复合物，最后 用底物显色剂显色。用底物显色剂显色。 优点：优点：简便、快速、特异性强，简便、快速、特异性强， 非特异性背景反应低。非特异性背景反应低。 缺点：缺点：浪费抗体、敏感性极低。浪费抗体、敏感性极低。 依靠化学连接（共价键）对酶及依靠化学连接（共价键）对酶及 抗体活性有影响。抗体活性有影响。 每种抗原必须分别用其抗体的酶每种抗原必须分别用其抗体的酶 标记物。标记物。 酶标抗体法酶标抗体法- -直接法直接法 酶标抗体法

4、酶标抗体法- -间接法间接法 原理：原理：将酶标记在二抗上，先将将酶标记在二抗上，先将 一抗与相应的抗原结合，形成抗一抗与相应的抗原结合，形成抗 原抗体复合物，再用二抗原抗体复合物，再用二抗( (酶标抗酶标抗 体体) )与复合物中的特异抗体结合，与复合物中的特异抗体结合， 形成形成复合物，复合物， 最后用底物显色剂显色。最后用底物显色剂显色。 优点：优点：只需一种酶标抗体即可只需一种酶标抗体即可 。 缺点：缺点：敏感性低，但优于直接法。敏感性低，但优于直接法。 依靠化学连接对酶及抗体活性有依靠化学连接对酶及抗体活性有 影响。影响。 v 免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记免疫酶组织化学方

5、法最终的生成物是带有酶标记 的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶的抗原抗体复合物，再依据酶与底物作用生成不溶 性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位，并借此确 定该抗原的性质、存在的部位和含量。定该抗原的性质、存在的部位和含量。 v 酶酶 + + 底物底物=不溶性的色素不溶性的色素 标记酶标记酶: : 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 (HRP)(HRP) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(ALP)(ALP) 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(GOD)(GOD) -D- -D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 v 显色反应显色反应 : 1 1 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 HRPH

6、RP： 显色：显色：产物棕褐色产物棕褐色 HRPHRP与与底物过氧化氢和底物过氧化氢和DABDAB作用产物棕褐色，有嗜锇性。作用产物棕褐色，有嗜锇性。 DABDAB性质：性质： 电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期电子供体，较敏感，室温时较稳定，显色后切片可长期 保存。可致癌，可将保存。可致癌，可将DABDAB制成制成1010倍浓度储存液，分装后倍浓度储存液，分装后-20-20 贮存。贮存。 注意事项：注意事项：孵育时间和配置方式易产生背景着色孵育时间和配置方式易产生背景着色 浓缩的浓缩的DABDAB按照说明书；注意校正蒸馏水的按照说明书；注意校正蒸馏水的PHPH值；值； 粉剂粉剂

7、DAB-DAB-溶解时滤去不溶性颗粒；溶解时滤去不溶性颗粒； 现用现配现用现配-保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。保存时可产生氧化物沉积在切片上，形成斑点。 临用前加临用前加H H2 2O O2 2 v2 2 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 ALPALP： v显色：产物蓝色或红色。显色：产物蓝色或红色。 v以磷酸萘酚以磷酸萘酚AS-MXAS-MX为底物，被为底物，被ALPALP水解后生成萘酚水解后生成萘酚 AS-MXAS-MX，再与孵育液内的坚牢蓝，再与孵育液内的坚牢蓝B B盐或坚牢红盐或坚牢红TRTR盐等盐等 偶联生成不溶性染料偶联生成不溶性染料( (坚牢蓝或坚牢红坚牢蓝或坚牢红) )而成。而

8、成。 v优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被优点：细胞和组织内的内源性碱性磷酸酶很容易被 抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高抑制和破坏，而不会产生内源性酶显色，从而提高 特异性。特异性。 v缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明缺点：显色弥散，不如过氧化物酶系统的清晰和明 确。确。 3 GOD(3 GOD(葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶) )： 以以-D-D-葡萄糖底物葡萄糖底物，被，被GODGOD氧化生成的氧化生成的H H2 2O O2 2，又作为，又作为 HRPHRP的催化底物，最后仍可用的催化底物，最后仍可用DABDAB显色。显色。 适用于两种酶的放大技术：适用于两种酶

9、的放大技术： 即用即用GODGOD和和HRPHRP分别标记第二和第三抗体分别标记第二和第三抗体( (如第一抗体是如第一抗体是 小鼠小鼠mAbmAb，第二抗体为，第二抗体为GODGOD标记的兔抗小鼠标记的兔抗小鼠IgGIgG，第三抗，第三抗 体为体为HRPHRP标记的羊抗兔标记的羊抗兔IgG)IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又，孵育液即含有葡萄糖，又 含有含有DABDAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。 呈色反应注意要点：呈色反应注意要点： 底物浓度：底物浓度： 应够高，保证最大反应速度应够高，保证最大反应速度; ; pH pH值：值： 满足酶活性的最适

10、满足酶活性的最适pHpH，常由缓冲液提供，常由缓冲液提供; ; 温度：温度： 室温即室温即18-2218-22，或，或3737； 时间时间： 显色反应时间应在镜下观察来控制，显色反应时间应在镜下观察来控制， 以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可以特异性显色清晰而背景又无非特异性着色时即可 终止反应。终止反应。 （二）染色程序（二）染色程序 1 1 直接法（冰冻切片）直接法（冰冻切片） 1 1）新鲜组织切片）新鲜组织切片, ,冷丙酮固定冷丙酮固定10min,10min,干燥后干燥后, ,入入PBSPBS。 2 2）0.3H H2 2O O2 2 - -甲醇液处理甲醇液处理30,30,封闭

11、内源性过氧化物酶封闭内源性过氧化物酶; ; 3 3）0.0l molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。 4) 54) 5-10-10正常羊血清室温处理正常羊血清室温处理30min30min。 5) 1:50-1:100 HRP-5) 1:50-1:100 HRP-标记抗体标记抗体, 37, 37孵育孵育6060或或44过夜。过夜。 6) 6) 0.0l molmolL PBSL PBS洗洗3 3次。次。 7) DAB7) DABH H2 2O O2 2显色显色( (新鲜配制新鲜配制) )。 8) 8) 0.01molmolLPBSLPBS洗洗3 3次。次。 9) 9) 梯度乙醇脱水，二甲

12、苯透明，封片。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。 2 2 间接法间接法 1) 1) 石蜡切片脱蜡至水；石蜡切片脱蜡至水； 冰冻切片冰冻切片 室温干燥室温干燥-丙酮固定丙酮固定-缓冲液漂洗溶去缓冲液漂洗溶去OCTOCT包埋剂包埋剂 2) 2) 甲醇双氧水室温处理切片甲醇双氧水室温处理切片151530min,30min,封闭内源性过氧化物酶活性。封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS3) PBS漂洗漂洗 4) 4) 0.11 1牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA),(BSA),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育151525,25,然后吸去孵然后吸去孵 育液育液, ,不冲洗不冲洗. . 5% 5%1010正

13、常兔血清正常兔血清( (或山羊血清或山羊血清),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育15152020然后吸去。然后吸去。 5)5)滴加滴加PBSPBS适当稀释的第一抗体适当稀释的第一抗体, ,湿盒内孵育湿盒内孵育, ,或或44过夜过夜, ,或室温或室温2 24h4h。 6) PBS6) PBS充分冲洗充分冲洗 7) 7) 滴加适当稀释的酶标第二抗体滴加适当稀释的酶标第二抗体, ,湿盒孵育湿盒孵育454560(60(室温或室温或37)37)。 8) PBS8) PBS漂洗漂洗(3(3次次, ,每次每次2-5)2-5)。 9)9)显色：显色： HRP HRP标记抗体（标记抗体（0.01- -0.1%

14、H% H2 2O O2 2 + + 0.01- -0.5DABDAB液）液） ALP ALP标记抗体标记抗体 （2mg2mg磷酸萘酚磷酸萘酚AS-MX+AS-MX+0.2mlml二甲基甲酰胺，用前加坚牢红二甲基甲酰胺，用前加坚牢红TRTR盐盐) )。 切片入此液切片入此液, ,室温室温10101515。 GOD GOD标记抗体标记抗体 （-D-D-葡萄糖葡萄糖67mg + 67mg + 硝基蓝四唑硝基蓝四唑6.7mg+6.7mg+吩嗪甲硫酸酯吩嗪甲硫酸酯0.107mgmg， 3737孵育孵育1h1h。 10) 10) 流水中终止呈色反应；流水中终止呈色反应； 11) 11) 复染细胞核（甲绿、

15、苏木精）；复染细胞核（甲绿、苏木精）；10s10s 12) DAB12) DAB显色标本显色标本-树胶封固。树胶封固。 其它其它-水溶性介质水溶性介质( (如甘油明胶如甘油明胶) )封固。封固。 13) 13) 镜检结果：按上法镜检结果：按上法HRPHRP阳性者呈棕色，阳性者呈棕色，ALPALP法阳性者呈红法阳性者呈红 色，色，GODGOD法阳性者呈蓝色。法阳性者呈蓝色。 二、非酶标抗体免疫组织化学染色法二、非酶标抗体免疫组织化学染色法 酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法酶桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 PAPPAP ( (一一) ) 酶桥法酶桥法 1 1 原理：三种抗体原理：三种抗体 一抗一抗

16、 二抗二抗-桥抗体桥抗体 三抗三抗-抗酶抗酶(HRP)(HRP)抗体抗体, , 酶酶(HRP)(HRP)与抗酶抗体结合与抗酶抗体结合, ,经底物的显色反应将抗原显示出来。经底物的显色反应将抗原显示出来。 优点：优点：任何抗体均未被酶标记任何抗体均未被酶标记, ,酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合, , 避免因避免因 共价结合对抗体和酶活性的影响共价结合对抗体和酶活性的影响, ,敏感性高敏感性高, , 可节约一抗。可节约一抗。 需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。需要同一种属动物制备一抗和抗酶抗体。 非标记抗体酶法非标记抗体酶法 酶桥法酶桥法 原理：原理：首先用酶免

17、疫动物，制备首先用酶免疫动物，制备 效价高、特异性强的抗酶抗体；效价高、特异性强的抗酶抗体； 以二抗作桥，将抗酶抗体联结在以二抗作桥，将抗酶抗体联结在 一抗上；一抗上； 再将酶结合在抗酶抗体再将酶结合在抗酶抗体 上，形成上，形成 复合物，最后用底物显色剂显色。复合物，最后用底物显色剂显色。 优点：优点：任何抗体均未被酶标记。任何抗体均未被酶标记。 酶是通过免疫学原理与酶抗体结酶是通过免疫学原理与酶抗体结 合的。避免了共价连接对抗体和合的。避免了共价连接对抗体和 酶活性的损害，提高了方法的敏酶活性的损害，提高了方法的敏 感性，而且节省一抗的用量。感性，而且节省一抗的用量。 缺点：缺点：敏感性低，

18、抗酶抗体不易敏感性低，抗酶抗体不易 纯化。纯化。 2 2 酶桥法染色程序酶桥法染色程序 同上述酶标抗体法。同上述酶标抗体法。 滴加滴加第一抗体第一抗体, ,于湿盒内于湿盒内44孵育孵育161624h24h。 PBS PBS洗洗2 2次，每次次，每次5(5(可振摇可振摇) )。 加加第二抗体第二抗体( (桥抗体桥抗体),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次55。 加加抗酶抗酶(HRP)(HRP)抗体抗体, ,湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育30306060。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次55。 加加过氧化物酶过氧化物酶(HR

19、P)(HRP)溶液溶液(70(70100g100gm1),m1),湿盒内室温湿盒内室温 孵育孵育3030。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次55。换。换TrisTris缓冲液洗缓冲液洗55。 显色反应及后处理同酶标记法。显色反应及后处理同酶标记法。 酶桥法的缺点：酶桥法的缺点： 抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体；抗酶抗体内存在低亲和力和高亲和力两类抗体； 低亲和力抗酶抗体低亲和力抗酶抗体-与酶结合力较弱，漂洗时易解离，与酶结合力较弱，漂洗时易解离， 可使约可使约7070的酶丢失，因而降低了方法的敏感性；的酶丢失，因而降低了方法的敏感性； 在抗酶抗体内，也含有在抗酶抗体内，也

20、含有非特异性非特异性( (抗酶抗酶) )抗体抗体，因其抗，因其抗 原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未原性与抗酶抗体相同，故也可与桥抗体结合，由于其未 与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。与酶结合，也会影响细胞组织内抗原的显示。 ( (二二) PAP) PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法）法（过氧化物酶抗过氧化物酶法） PAPPAP复合物：复合物： 抗酶抗体抗酶抗体 + + 足量的酶足量的酶 = = 形成稳定的五角形复合物形成稳定的五角形复合物 ( (由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成) ) 原理：三种抗体原理：三种抗体 PAP

21、PAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。 一抗一抗 二抗二抗-桥抗体桥抗体 PAPPAP复合物复合物 要求：要求： 抗酶抗体的动物种属应和制各第一抗体的动物相同。抗酶抗体的动物种属应和制各第一抗体的动物相同。 非标记抗体酶法非标记抗体酶法 -PAP-PAP法法 双双PAPPAP法法 原理：原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体同酶桥法，只是把抗酶抗体- -酶制成酶制成 复合物（复合物（PAPPAP复合物），形成复合物），形成 复合物。复合物。 优点：优点：比直接法、间接法、酶桥法更敏感。比直接法、间接法、酶桥法更敏感。 特别适用于石蜡切片中微量抗原和抗原性减特别适用于石蜡

22、切片中微量抗原和抗原性减 弱抗原的检测。弱抗原的检测。 缺点：缺点：步骤较多，时间较长，不适用于临床步骤较多，时间较长，不适用于临床 常规检查。常规检查。 v优点：优点： PAP PAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法 高高2020倍；倍； PAP PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色；是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色； 双双PAPPAP法：通过两次连接桥抗体和法：通过两次连接桥抗体和PAPPAP复合物，在抗原抗体复合物上结复合物，在抗原抗体复合物上结 合了更多

23、的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和 抗原性减弱的抗原检测。抗原性减弱的抗原检测。 v缺点：缺点： PAP PAP复合物制备较复杂；复合物制备较复杂； 免疫染色步骤多、需时长；免疫染色步骤多、需时长； 由于由于PAPPAP复合物分子量较大，对组织的穿透力不如酶标抗体，故不适复合物分子量较大，对组织的穿透力不如酶标抗体，故不适 于免疫电镜标本制作。于免疫电镜标本制作。 2 PAP2 PAP染色程序染色程序 同上述酶标抗体法。同上述酶标抗体法。 加加第一抗体第一抗体, ,湿盒内湿盒内44孵育孵育161624h24h

24、。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5min,5min,可振摇。可振摇。 加加桥抗体桥抗体( (即羊抗兔即羊抗兔IgG),IgG),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育3030 用用PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次55，可振摇。，可振摇。 加加PAPPAP复合物复合物( (由兔制备抗酶抗体由兔制备抗酶抗体),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育33 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次55。再换入。再换入TrisTris缓冲液洗缓冲液洗55。 用用TBSTBS配制的配制的H H2 2O O2 2-DAB-DAB底物显色底物显色5 510(10(镜下观察控制镜下观察控制) )。 流

25、水冲洗。流水冲洗。 需要时可复染细胞核。需要时可复染细胞核。 脱水、透明、封固。脱水、透明、封固。 双双PAPPAP法染色程序：法染色程序： 同同PAPPAP法。法。 用用PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次5min5min。 再加再加桥抗体桥抗体( (羊抗兔羊抗兔IgGIgG抗体，比第一次稀释大一倍抗体，比第一次稀释大一倍) )， 湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育30min30min。 PBS PBS洗洗2 2次，每次次，每次5min5min。 再加再加PAPPAP复合物复合物( (比第一次稀释大一倍比第一次稀释大一倍) )，湿盒内孵育，湿盒内孵育 30min30min。 以后按上述以后按上述

26、PAPPAP法法12121515进行。进行。 其它免疫组化方法其它免疫组化方法 v免疫组化技术成熟的过程免疫组化技术成熟的过程= =提高提高IHCIHC敏感性敏感性= =提高放大提高放大 信号信号= =抗原抗原+ +？酶？酶 生物素生物素(Biotin) (Biotin) ：Vitamin HVitamin H、 活化后可标记抗体和酶而不影响其活性活化后可标记抗体和酶而不影响其活性 卵白素卵白素(Avidin):(Avidin):亲和素、抗生物素亲和素、抗生物素 碱性蛋白质；具有碱性蛋白质；具有4 4个生物素结合位点个生物素结合位点 链霉卵白素：链霉卵白素： 从链霉菌中提取出来，等电点接近中性

27、，对组织细胞的非特异从链霉菌中提取出来，等电点接近中性，对组织细胞的非特异 吸附很低，是与生物素结合更加完美的一种蛋白质。吸附很低，是与生物素结合更加完美的一种蛋白质。 生物素生物素- -卵白素、生物素卵白素、生物素- -链霉卵白素：链霉卵白素： 具有高度亲和力，是抗原抗体结合能力的上千倍。具有高度亲和力，是抗原抗体结合能力的上千倍。 vABC法法 、SP法、法、SABC法、法、EnVision法、法、CSA法法 ABCABC法（亲和素生物素过氧化物酶复合物法法（亲和素生物素过氧化物酶复合物法） v亲和素亲和素Avidin: Avidin: 糖蛋白，其上有四个与生物素相结合的位点。糖蛋白，其上

28、有四个与生物素相结合的位点。 v生物素生物素BiotinBiotin：维生素：维生素H H，两者亲和力巨大，牢不可破。，两者亲和力巨大，牢不可破。 vABCABC法与法与PAPPAP法的区别是：以法的区别是：以ABCABC复合物代替复合物代替PAPPAP复合物。复合物。 1 1）ABCABC复合物的制备：复合物的制备： ABCABC法反应原理法反应原理 ABCABC染色程序染色程序 同上述酶标抗体法。同上述酶标抗体法。 加加第一抗体第一抗体, ,湿盒内湿盒内44孵育孵育161624h24h。 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次5min,5min,可振摇。可振摇。 加加生物素化抗体生物

29、素化抗体( (即羊抗兔即羊抗兔IgG),IgG),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育3030 用用PBSPBS洗洗2 2次，每次次，每次55，可振摇。，可振摇。 加加ABCABC复合物复合物( (亲合素一生物素过氧化物酶复合物亲合素一生物素过氧化物酶复合物 ),),湿盒内室温孵育湿盒内室温孵育33 用用PBSPBS洗洗2 2次次, ,每次每次55。再换入。再换入TrisTris缓冲液洗缓冲液洗55。 用用TBSTBS配制的配制的H H2 2O O2 2-DAB-DAB底物显色底物显色5 510(10(镜下观察控制镜下观察控制) )。 流水冲洗。流水冲洗。 需要时可复染细胞核。需要时可复染细胞核。 脱

30、水、透明、封固。脱水、透明、封固。 SP/SAPSP/SAP法法 该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良法基础上的进一步改良. . 与链霉卵白素（而非生物素）结合，而后再结合与链霉卵白素（而非生物素）结合，而后再结合POPO。它有四。它有四 个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。个亚基可与生物素结合，灵敏度特异，背景低，成本低。 优点：更简洁，放大倍数优点：更简洁，放大倍数，等电点中性更适合组织。，等电点中性更适合组织。 分子量小，穿透力分子量小，穿透力。 一抗一抗 + + 生物素标记二抗生物素标记二抗 + + 辣根酶标记链霉卵白素辣根酶标记链霉卵白素 + + 辣根酶底物显色

31、辣根酶底物显色 其它免疫组化方法其它免疫组化方法-SP 原理：原理： + + 一抗一抗 + + 生物素化二抗生物素化二抗 + HRP+ HRP标记的链霉卵白素标记的链霉卵白素 优点：优点： 高灵敏度高灵敏度 低背景低背景 操作方便操作方便 缺点：缺点： 不适用于内源性生物素丰富的组织不适用于内源性生物素丰富的组织 （过氧化物酶标记的链霉卵白素（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色) v三步法（以三步法（以SPSP试剂盒为例）试剂盒为例） 石蜡切片脱蜡至水。石蜡切片脱蜡至水。 蒸馏水冲洗，蒸馏水冲洗，PBSPBS浸泡浸泡5 5分钟，如需采用抗原

32、修复，可在此步后进行。分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3%H 3%H2 2O O2 2室温孵育室温孵育5-105-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBSPBS冲洗，冲洗，2 2 分钟分钟3 3次。次。 5-10% 5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育正常山羊血清封闭，室温孵育1010分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当 比例稀释的比例稀释的一抗一抗或一抗工作液，或一抗工作液，3737孵育孵育1-21-2小时或小时或44过夜。过夜。 PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。 滴加适当比例稀释的滴加适当比例

33、稀释的生物素标记二抗生物素标记二抗（1%BSA-PBS1%BSA-PBS稀释），稀释），3737孵育孵育10-10- 3030分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，3737或室温孵育或室温孵育10-2010-20分钟。分钟。 PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。 滴加适当比例稀释的滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素辣根酶标记链霉卵白素（PBSPBS稀释），稀释），3737孵育孵育10-10- 3030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，3737或室温孵育或室温孵育10-2010-20

34、分钟。分钟。 PBS PBS冲洗，冲洗，2 2分钟分钟3 3次。次。 显色剂显色（显色剂显色（DABDAB或或AECAEC）。）。 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。 SABC法 原理：原理： 一抗生物素化二抗一抗生物素化二抗SABCSABC复合物复合物 SABCSABC复合物复合物 生物素标记的二抗生物素标记的二抗 链霉卵白素连接链霉卵白素连接 生物素标记的酶。生物素标记的酶。 优点：优点：敏感性略高于敏感性略高于SPSP法，低背景和操法，低背景和操 作简便作简便 缺点：缺点：因体内含有内源性生物素，易产因体内含有内源性生物素，易

35、产 生非特异性染色。生非特异性染色。 其它免疫组化方法其它免疫组化方法-SABC 一抗一抗+ +生物素标记二抗生物素标记二抗+ +滴加试剂滴加试剂SABCSABC（链霉卵白素（链霉卵白素+ +辣根酶标记生物素辣根酶标记生物素)+)+辣根酶底物显色辣根酶底物显色 vSPSP法：法： 一抗一抗 + + 生物素标记二抗生物素标记二抗 + + 辣根酶标记链霉卵白素辣根酶标记链霉卵白素 + + 辣根辣根 酶底物显色酶底物显色 SABCSABC法：法： 一抗一抗 + + 生物素标记二抗生物素标记二抗 + + 滴加试剂滴加试剂SABCSABC（链霉卵白素（链霉卵白素 + + 辣根酶标记生物素辣根酶标记生物素

36、） + + 辣根酶底物显色辣根酶底物显色 SABCSABC为：链霉亲合素一生物素过氧化物酶复合物。为：链霉亲合素一生物素过氧化物酶复合物。 ABCABC为：亲合素一生物素过氧化物酶复合物。为：亲合素一生物素过氧化物酶复合物。 ( (反应原理是一样的，只是应用的亲和素不同。反应原理是一样的，只是应用的亲和素不同。) ) 原理：原理： 将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨 架联接成一个多聚体架联接成一个多聚体 优点：优点： 1 1 简便、快速、敏感性是简便、快速、敏感性是S-P/SABCS-P/SABC 法的几十倍。法的几十倍。 2 2 由于人体组织中不含有这种多聚由于人体

37、组织中不含有这种多聚 物，从而避免了组织中生物素的干物，从而避免了组织中生物素的干 扰扰 缺点：缺点： 因大分子穿透核膜困难因大分子穿透核膜困难, , 对于核内抗原的定位不能选用此法。对于核内抗原的定位不能选用此法。 Envision法 其它免疫组化方法其它免疫组化方法-EnvisionEnvision法法 vEnVisionEnVision工作程序：工作程序： 1 1） 脱蜡、水化组织切片。脱蜡、水化组织切片。 2 2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）预处理组织切片（据一抗具体说明而定） 3 3） 蒸馏水漂洗，置于蒸馏水漂洗，置于PBSPBS中。中。 4 4） 阻断内源性过氧化物酶（仅

38、用于阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRPEnVisionTM/HRP） 5 5） 蒸馏水漂洗，置于蒸馏水漂洗，置于PBSPBS，1010分钟分钟 6 6） 一抗一抗孵育孵育10-3010-30分钟分钟 7 7） PBSPBS漂洗漂洗1010分钟分钟 8 8） EnVisionEnVisionTMTM孵育孵育10-3010-30分钟分钟 9 9） PBSPBS漂洗漂洗1010分钟分钟 10) 10) 色源底物溶液孵育色源底物溶液孵育1010分钟分钟 11) 11) 蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗 12) 12) 复染及封片复染及封片 其它免疫组化方法其它免疫组化方法- CSACSA法（

39、催化信号放大法）法（催化信号放大法） 原理：原理： 是酪胺的过氧化物酶反应是酪胺的过氧化物酶反应(即即HRP催化酪胺催化酪胺 盐，形成共价键结合位点盐，形成共价键结合位点)，产生大量的酶，产生大量的酶 促产物，该产物能与周围的蛋白残基促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括包括 色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样结合，这样 在抗原在抗原抗体结合部位就有大量的生物素沉抗体结合部位就有大量的生物素沉 积，与随后加入的链霉亲和素积，与随后加入的链霉亲和素HRP结合，结合， 如经几次这样的循环放大，可以网络许许多如经几次这样的循环放大，可以网络许许多 多的酶分子，最后通过多

40、的酶分子，最后通过DAB的显色反应，的显色反应， 其敏感性得到几何级放大。其敏感性得到几何级放大。 优点：优点： 比比EnVision法敏感法敏感20100倍。倍。 适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性适合于实验病理学和第一抗体昂贵、抗原性 较弱的较弱的IHC检测以及抗原破坏严重、抗原量检测以及抗原破坏严重、抗原量 较少的组织细胞抗原的检测方法较少的组织细胞抗原的检测方法; 核内抗原的检测（原为杂交）。核内抗原的检测（原为杂交）。 缺点：缺点： 操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源操作步骤多、孵育时间长，存在严重的内源 性干扰，背景染色有时较重。性干扰，背景染色有时较重。 三、免疫酶组织化

41、学染色操作中的注意事项三、免疫酶组织化学染色操作中的注意事项 1 1 实验设计实验设计 列出实验目的列出实验目的; ; 所有抗体种类所有抗体种类; ; 拟用方法拟用方法; ; 选用病例的诊断及其切片选用病例的诊断及其切片( (如系动物实验，则同样应有研究计划如系动物实验，则同样应有研究计划) )，应逐，应逐 一记于玻片上，可用编码或符号表示一记于玻片上，可用编码或符号表示; ; 每一抗体均应配以阳性或阴性对照每一抗体均应配以阳性或阴性对照 2 2 湿盒孵育技术湿盒孵育技术 将切片平放于湿盒中，滴加抗体将切片平放于湿盒中，滴加抗体. . 切片较多，可分切片较多，可分2 23 3组，以便流水作业，

42、则可在一次试验内不停地完组，以便流水作业，则可在一次试验内不停地完 成大量工作成大量工作, ,放入切片后加盖以防干燥，置放入切片后加盖以防干燥，置3737恒温箱内孵育。恒温箱内孵育。 3 3 抗原修复抗原修复 定义：定义：抗原修复是指恢复抗原原有的空间状态。抗原修复是指恢复抗原原有的空间状态。 原理：原理：组织经甲醛等固定后，形成醛键而封闭了抗原，或者被甲醛在组织经甲醛等固定后，形成醛键而封闭了抗原，或者被甲醛在 蛋白质之间形成的交联结构所隐蔽，因此，在进行免疫组织化学染色蛋白质之间形成的交联结构所隐蔽，因此，在进行免疫组织化学染色 时，需要破坏分子间的交联等结构修复或暴露被封闭或隐藏的抗原。

43、时，需要破坏分子间的交联等结构修复或暴露被封闭或隐藏的抗原。 抗原修复后可以重新释放抗原，从而增加染色强度。抗原修复后可以重新释放抗原，从而增加染色强度。 方法：方法：化学修复法、物理化学修复法化学修复法、物理化学修复法 (1) (1) 化学修复法化学修复法 胰蛋白酶、胃蛋白酶、链酶蛋白酶等胰蛋白酶、胃蛋白酶、链酶蛋白酶等。 1) 0.11) 0.1胰蛋白酶液：孵育前将胰蛋白酶溶入氯化钙液内胰蛋白酶液：孵育前将胰蛋白酶溶入氯化钙液内, ,混匀后混匀后, ,放入切放入切 片片, ,消化消化5-305-30。 2) 0.42) 0.4胃蛋白酶液：溶于胃蛋白酶液：溶于0.01 mol0.01 mol

44、L L盐酸中盐酸中,37,37消化消化5-305-30。 3) 0.063) 0.06链霉蛋白酶液：溶于链霉蛋白酶液：溶于0.5mol0.5molL L的的TrisTris缓冲液中缓冲液中,37,37消化消化5-5- 3030。 (2)(2)物理化学修复法物理化学修复法 器具：器具：微波炉、真空负压干燥箱、高压锅、电炉或水浴锅等微波炉、真空负压干燥箱、高压锅、电炉或水浴锅等 抗原修复液抗原修复液: : TBS TBS、PBSPBS、重金属盐溶液等，、重金属盐溶液等， 其中以其中以0.0l molmolL L枸橼酸盐缓冲液枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)(PH6.0)最常用。最常用。 1)1)微波辐

45、射抗原修复法微波辐射抗原修复法 切片脱蜡至水切片脱蜡至水 双蒸水洗双蒸水洗 放到盛有枸橼酸盐缓冲液容器中放到盛有枸橼酸盐缓冲液容器中 置微波炉内加热置微波炉内加热 92-9892-98以上持续以上持续10-15 min 10-15 min 取出自然冷却取出自然冷却 注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却。然后，经双蒸水、注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却。然后，经双蒸水、PBSPBS洗，下接免洗，下接免 疫组织化学步骤。疫组织化学步骤。 原理：原理：该法利用微波该法利用微波24.524.5亿次秒的高速运动产生瞬间热，微波辐射使各亿次秒的高速运动产生瞬间热，微波辐射使各 分子作极性运动，热使甲醛固定

46、的蛋白质发生变性，在此双重作用下，达分子作极性运动，热使甲醛固定的蛋白质发生变性，在此双重作用下，达 到抗原修复目的。到抗原修复目的。 2)2)高压热抗原修复法高压热抗原修复法 切片脱蜡到水后，置金属切片架上。将盛有枸橼酸盐缓冲液的不切片脱蜡到水后，置金属切片架上。将盛有枸橼酸盐缓冲液的不 锈钢高压锅加热至溶液沸腾。将切片架放到锅内，加盖压力阀，压力锅锈钢高压锅加热至溶液沸腾。将切片架放到锅内，加盖压力阀，压力锅 喷气持续喷气持续l-2minl-2min，再将压力锅端离热源，凉至室温后，去阀开盖，取出，再将压力锅端离热源，凉至室温后，去阀开盖，取出 切片，经双蒸水、切片，经双蒸水、PBSPBS

47、洗，下接免疫组织化学步骤。这也是一种双重作用洗，下接免疫组织化学步骤。这也是一种双重作用 的方法，高压也易使甲醛固定的蛋向质发生变性，高压下的温度一般在的方法，高压也易使甲醛固定的蛋向质发生变性，高压下的温度一般在 l00l00120120之间。之间。 此法对于较难修复的抗原的修复效果较好。此法对于较难修复的抗原的修复效果较好。 3) 3)煮沸热抗原修复法煮沸热抗原修复法 切片脱蜡到水后置金属切片架上，放入盛有枸橼酸盐缓冲液小容器切片脱蜡到水后置金属切片架上，放入盛有枸橼酸盐缓冲液小容器 中，将器置于另一个盛有自来水的大容器中，电炉加热至沸腾，等小容中，将器置于另一个盛有自来水的大容器中，电炉

48、加热至沸腾，等小容 器的温度达器的温度达92929898时，再持续时，再持续15-20min15-20min，然后端离电炉，室温自然冷，然后端离电炉，室温自然冷 却，经双蒸水、却，经双蒸水、PBSPBS洗后，下接免疫组织化学步骤。洗后，下接免疫组织化学步骤。 4)4)电炉加热抗原修复法电炉加热抗原修复法 切片脱蜡到水后置金属切片架上，放到盛有枸橼酸盐缓冲液的烧杯切片脱蜡到水后置金属切片架上，放到盛有枸橼酸盐缓冲液的烧杯 内，于电炉上加热，当温度达到内，于电炉上加热，当温度达到9595时关闭电源，当温度下降时重开电时关闭电源，当温度下降时重开电 源。如此反复，维持源。如此反复，维持10min.1

49、0min. 抗原修复液抗原修复液- -枸橼酸盐缓冲液的枸橼酸盐缓冲液的pHpH值很重要，不同的抗体进值很重要，不同的抗体进 行免疫组织化学染色时抗原修复所需最佳行免疫组织化学染色时抗原修复所需最佳pHpH值需要摸索或查值需要摸索或查 阅有关资料。阅有关资料。 石蜡切片热修复适于核抗原，易被固定破坏的抗原。石蜡切片热修复适于核抗原，易被固定破坏的抗原。 石蜡切片酶消化程序适于被固定遮蔽的抗原。石蜡切片酶消化程序适于被固定遮蔽的抗原。 温度温度 修复液的修复液的pHpH值值 抗原热修复的基本原则抗原热修复的基本原则 二个主要因素：二个主要因素： 抗原热修复温度和时间的关系抗原热修复温度和时间的关系

50、 时时 间间 ( (分钟分钟) ) 100C80C60C 5 2 +- 5 6+- 510-+ + - 10小时小时-+ NGF单克隆抗体免疫组化灵敏度实验单克隆抗体免疫组化灵敏度实验 在一定范围内，在一定范围内， 加热温度（加热温度（T T）X X 加热时间（加热时间（t t）= =抗原热修复的有效性抗原热修复的有效性 高温可以缩短修复时间高温可以缩短修复时间 低温需要更长的修复时间低温需要更长的修复时间 某些蛋白（抗原）需要较低温度的修复某些蛋白（抗原）需要较低温度的修复 微波炉修复和高压锅修复的比较微波炉修复和高压锅修复的比较 温温 度度 压压 力力时时 间间受受 热热 微波炉微波炉10

51、0C1P1520分钟不均匀 高压锅高压锅120C1.2P喷气2分钟均匀 单克隆抗体单克隆抗体 CD3 克隆系：克隆系：PS1(PH6.0) 微波炉微波炉10min高压锅高压锅2min 试验了七种不同的缓冲液，试验了七种不同的缓冲液，pH值从值从1-10 九种单克隆抗体，阳性表达部位包括胞核、九种单克隆抗体，阳性表达部位包括胞核、 胞浆、胞膜胞浆、胞膜 试验结果归纳为四种曲线试验结果归纳为四种曲线 pHpH值对抗原热修复的影响值对抗原热修复的影响 抗原热修复抗原热修复:pH:pH值的影响值的影响 A 稳定型抗体：稳定型抗体：pH值改变对实验结果影响不大值改变对实验结果影响不大 B “V”型抗体：

52、强酸强碱修复液效果好，但强酸条型抗体：强酸强碱修复液效果好，但强酸条 件件 下，细胞皱缩变形，影响观察下，细胞皱缩变形，影响观察 C 上升型抗体：修复液上升型抗体：修复液pH值越高，效果越好值越高，效果越好 D 下降型抗体：适用于酸性修复液下降型抗体：适用于酸性修复液 四种类型的抗体四种类型的抗体 大多数试验室用枸橼酸盐缓冲液（大多数试验室用枸橼酸盐缓冲液（pH6.0), 优点背景清晰优点背景清晰 高高pH值的修复液适用于大多数的抗体值的修复液适用于大多数的抗体 如使用如使用pH9.0的修复液，可适当提高一抗的修复液，可适当提高一抗 的效价的效价 pHpH值是抗原热修复的关键因素值是抗原热修复

53、的关键因素 抗抗 原原 修修 复复 Calponin： 用用 不不 同同 pH 值值 修修 复复 液液 的的 实实 验验 结结 果果 NegR-2R-4R-6R-8R-10 抗抗 原原 修修 复复 D2-40：不同不同pHpH值修复液对比值修复液对比 1:150pH6.0 1:300 pH9.0 Fixation 7 d Pronase 5 min Fixation 7 d Pronase 15 m in CD15 1:50, HIER Ci pH6CD15 1:10 HIER Tris/EDTA pH9 Hodgkins lymphoma MC Staining false negative

54、 Protocol template Too low sensitivity 说说 明明 Fixation 7 d Pronase 5 min Fixation 7 d Pronase 15 m in CD15 1:50, HIER Ci pH6CD15 1:10 HIER Tris/EDTA pH9 Hodgkins lymphoma MC Staining false negative Protocol template Too low sensitivity CD15 1:50,HIER Ci pH6CD15 1:100,HIER Tris/EDTA pH9 ER:ER:同一浓度不同修复

55、液比较同一浓度不同修复液比较 pH6.0 pH9.0 固定时间对修复的影响固定时间对修复的影响 固定时间越长，需要的修复强度越强固定时间越长，需要的修复强度越强 同等修复条件下，必须延长修复时间同等修复条件下，必须延长修复时间 或提高修复的强度或提高修复的强度 固定时间对抗原修复的影响固定时间对抗原修复的影响 多克隆抗体多克隆抗体S-100 神经纤维及神经纤维及 恶黑肿瘤细胞恶黑肿瘤细胞 均为阳性表达均为阳性表达 单克隆抗体单克隆抗体S-100 神经纤维阳神经纤维阳 性性 恶黑肿瘤细胞无阳性表达恶黑肿瘤细胞无阳性表达 中性福尔马林固定中性福尔马林固定48小时小时 中性福尔马林固定中性福尔马林固

56、定72小时小时 目的目的 减低非特异性杂交减低非特异性杂交 时间时间 Bio / Dig 探针可缩探针可缩 短为短为15min 杂交后的冲洗杂交后的冲洗 4 4 抗体的稀释度抗体的稀释度 (1)(1)抗体的浓度抗体的浓度 工作抗体滴度：工作抗体滴度：抗体在稀释液中的浓度，每毫升溶液中所抗体在稀释液中的浓度，每毫升溶液中所 包含的抗体分子愈多包含的抗体分子愈多, ,则溶液的滴度亦愈高。则溶液的滴度亦愈高。 选择标准：选择标准：待测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。待测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。 微量加样器微量加样器: :为为10ul10ul、20ul20ul、50ul50ul、100ul

57、100ul和和200ul200ul。 抗体稀释后应充分混匀。抗体稀释后应充分混匀。 抗原与抗体浓度的比例十分重要。抗体浓度过高，反而减少抗原与抗体浓度的比例十分重要。抗体浓度过高，反而减少 抗体与抗原的结合，导致假阴性，当使用一种新抗体时，必抗体与抗原的结合，导致假阴性，当使用一种新抗体时，必 须试用多种稀释度，应根据抗体和待染标本等具体情况，确须试用多种稀释度，应根据抗体和待染标本等具体情况，确 定最佳工作滴度，以防止假阴性结果的出现。定最佳工作滴度，以防止假阴性结果的出现。 影响稀释度因素：影响稀释度因素：标本的固定、切片种类、稀释液种类、湿标本的固定、切片种类、稀释液种类、湿 盒的具体条

58、件等。盒的具体条件等。 (2) (2) 抗体的稀释方法抗体的稀释方法 1) 1) 直接测定法：直接测定法：其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度其它条件稳定，用于测定一抗最佳稀释度 或直接染色法，以确定第一抗体的最佳稀释度。从表中可或直接染色法，以确定第一抗体的最佳稀释度。从表中可 知在知在1:100与与1:2001:200间可找出第一抗体的最佳浓度。间可找出第一抗体的最佳浓度。 一抗稀释度一抗稀释度特异性染色强度特异性染色强度非特异性染色强度非特异性染色强度 1:50+ 1:100+ 1:200+ 阴性对照阴性对照 v2)2)棋盘棋盘( (方阵方阵) )测定法：测定法：欲测知二种以上抗体的最佳

59、浓度，欲测知二种以上抗体的最佳浓度， 可比较可比较9 9张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应张标本的阳性反应和背景着色。从下表可知，应 采用采用1 1：2020的第二抗体，并进一步在的第二抗体，并进一步在l:50l:501:1001:100之间寻找之间寻找 第一抗体的最佳工作稀释度。第一抗体的最佳工作稀释度。 表表3-2 抗体的最佳滴度测试表抗体的最佳滴度测试表 第二抗体第二抗体第一抗体第一抗体 稀释度稀释度1：501：1001：200 1：20+（+）+（）（）+（）（） 1：40+（）（）+（）（）+（）（） 1：80+（）（）+（）（）+（）（） 注：括号内为背景着色注：括号内为背

60、景着色 (3)(3)抗体稀释液抗体稀释液: : 0.0l mol0.0l molL PBSL PBS、TrisTris缓冲液缓冲液 专用抗体稀释液专用抗体稀释液( (含含5 5BSABSA，0.10.1NaNNaN3 3，0.0250.025Triton X100Triton X100PBS)PBS) 稀释后抗体的放置时间不宜过久稀释后抗体的放置时间不宜过久 5 5 滴加抗体技术滴加抗体技术 正常动物血清处理后正常动物血清处理后, ,倾去多余血清倾去多余血清, ,滴加一抗滴加一抗, ,其他抗体均在玻片经其他抗体均在玻片经 PBSPBS洗后滴加。洗后滴加。 拭去组织周围的液体拭去组织周围的液体,