第2节 HPLC仪器装置

1、第二节第二节 HPLC仪器装置仪器装置 一、一、HPLC仪器装置仪器装置 n1. 高压输液系统高压输液系统; n2. 进样系统进样系统; n3. 分离系统分离系统; n4. 检测系统检测系统; n此外还配有梯度洗脱、自动进样及此外还配有梯度洗脱、自动进样及 数据处理系统等辅助装置。数据处理系统等辅助装置。 He 储液瓶储液瓶 分布器分布器 过滤过滤 2 m 高压泵高压泵 入口检查入口检查 出口出口 检查检查 脉流消除脉流消除 抽气抽气 过滤器过滤器 反压调节反压调节 压力计压力计 注样阀注样阀 分离柱分离柱 到检测器到检测器 图图5-4 HPLC仪器装置仪器装置 二、工作过程二、工作过程 (

2、(一一) ) 高压输液系统高压输液系统 1. 储液器储液器 2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器的玻璃瓶，配有溶剂过滤器 (Ni合金合金)，其孔径约，其孔径约2 m，可防止颗，可防止颗 粒物进入泵内。粒物进入泵内。 2. 脱气器脱气器 n 超声波脱气或真空加热脱气。超声波脱气或真空加热脱气。 溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对 分子量小的气体透过膜从溶剂中除分子量小的气体透过膜从溶剂中除 去去(气泡会影响检测气泡会影响检测)。 3. 高压泵高压泵 n是高压输液系统的核心部件。是高压输液系统的核心部件。 n要求：要求： n(1) 密封性好密封性好; n(2) 输出液体压力高输出

3、液体压力高: 1.5 107 4.5 107Pa; n(3) 输液流量稳定无脉动，精度输液流量稳定无脉动，精度0.1mL.min-1; n(4) 可调范围宽、耐腐蚀。可调范围宽、耐腐蚀。 4. 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 n在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。 梯度洗脱：梯度洗脱：把两种或两种以上不同性质但可互把两种或两种以上不同性质但可互 溶的溶剂，按一定程序连续改变流动相中多种溶的溶剂，按一定程序连续改变流动相中多种 不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、不同性质溶剂的配比，以改变流动相的极性、 离子强度或酸度，从而提高试样的分离效率，离子强度或酸度

4、，从而提高试样的分离效率， 缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测缩短分析时间，使色谱峰形得到改善，提高测 定的灵敏度和定量的准确度的方法。定的灵敏度和定量的准确度的方法。 ( (二二) )进样系统进样系统 n有手动和自动两种进样方式。有手动和自动两种进样方式。 nHPLC主要采用主要采用旋转式高压六通旋转式高压六通 阀阀进样。进样。 进样装置包括两种：进样装置包括两种： 1.隔膜注射进样隔膜注射进样 n 使用微量注射器进样。装置简单、死体使用微量注射器进样。装置简单、死体 积小。但进样量小且重现性差。积小。但进样量小且重现性差。 2.高压进样阀高压进样阀 n 目前最常用的为旋转式六通阀。如

5、图。目前最常用的为旋转式六通阀。如图。 装入样品装入样品 出口出口 进样进样 采样环采样环 泵入溶剂泵入溶剂 进色谱柱进色谱柱 图图5-7 旋转式六通阀旋转式六通阀 旋转式六通阀旋转式六通阀进样优点：进样优点： n(1) 进样量可变范围大。进样量可变范围大。 n(2) 进样准确，重复性好。进样准确，重复性好。 n(3) 耐高压，宜于自动化。耐高压，宜于自动化。 缺点：缺点： n易造成色谱峰柱前扩展。易造成色谱峰柱前扩展。 ( (三三) )分离系统分离系统 n色谱柱，它是高效液相色谱仪的心脏。色谱柱，它是高效液相色谱仪的心脏。 1. 对色谱柱的要求：对色谱柱的要求： n 内壁光滑的优质不锈钢或铜

6、、铝等金属，内壁光滑的优质不锈钢或铜、铝等金属， 柱接头的死体积尽可能小。柱长多为柱接头的死体积尽可能小。柱长多为525cm， 内径为内径为45mm。 2. 柱的填充柱的填充 n 主要分为干法和湿法。一般大颗粒采用干主要分为干法和湿法。一般大颗粒采用干 法填充，小颗粒采用湿法填充。湿法填充一般法填充，小颗粒采用湿法填充。湿法填充一般 采用匀浆法。采用匀浆法。 n 均浆法：均浆法： n 使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗 粒沉降速度趋于零。常用的匀浆试剂有四氯乙粒沉降速度趋于零。常用的匀浆试剂有四氯乙 烯、四溴乙烷和二碘甲烷等。烯、四溴乙烷和二碘甲烷等。 3

7、.填充方法填充方法 n 填充时，按上述方法制作匀浆液，填充时，按上述方法制作匀浆液， 用流动相充满色谱柱及其延长管中，然用流动相充满色谱柱及其延长管中，然 后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压 力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充 速度快速度快(防凝聚、沉降或结块防凝聚、沉降或结块)、且无空、且无空 气进入气进入(影响填充均匀性影响填充均匀性)。 ( (四四) )检测系统检测系统 n 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光、液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光、 示差折光、蒸发光散射和电化学检测器等。示差折光、蒸发光散射和电化学检测器等。

8、n要求：要求：n(1) 灵敏度高 灵敏度高 n(2) 噪声低噪声低 n(3) 线性范围宽线性范围宽 n(4) 响应快响应快 n(5) 死体积小死体积小 n(6) 对温度和流量的变化不敏感对温度和流量的变化不敏感 1. 1.紫外吸收检测器紫外吸收检测器(UVD) (1) 检测原理检测原理: n HPLC分析中，约有分析中，约有80%的物质可以在的物质可以在254 nm(单波长，汞灯单波长，汞灯)或或200400nm(多波长，氘灯多波长，氘灯) 范围产生紫外吸收，因此该类检测器应用很广。范围产生紫外吸收，因此该类检测器应用很广。 n 依据被分析组分对特定紫外光的选择吸收，依据被分析组分对特定紫外光

9、的选择吸收， 组分浓度与吸光度的关系服从比尔定律。组分浓度与吸光度的关系服从比尔定律。 石英窗石英窗 接色谱柱接色谱柱 UV 光电倍增管光电倍增管 废液废液 图图5-8 紫外吸收检测器紫外吸收检测器 (2) 优点优点 n(1) 灵敏度较高的浓度型检测器；灵敏度较高的浓度型检测器； n(2) 最小检测量可达最小检测量可达10-810-12g； n(3) 只对能产生紫外吸收的物质有响应；只对能产生紫外吸收的物质有响应； 几乎所有的有机物都有紫外吸收。几乎所有的有机物都有紫外吸收。 n(4) 对温度和流量不敏感；对温度和流量不敏感； n(5) 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 是是HPLC应用最广的

10、检测器应用最广的检测器 (3) 缺点缺点 n要求流动相的截止波长较低，低于检测要求流动相的截止波长较低，低于检测 器的工作波长。器的工作波长。 n截止波长：截止波长：流动相在此波长以上，流动相在此波长以上， 没有紫外吸收。没有紫外吸收。 n部分溶剂截止波长见书部分溶剂截止波长见书p345 表表17-1 表表2-1 几种主要溶剂的物理性质几种主要溶剂的物理性质 溶剂溶剂 溶解度参溶解度参 数数(硅胶硅胶) 黏度黏度/(mN.s. m-2) 20 C 折射率折射率 20 C 紫外截止紫外截止 波长波长/mm 正戊烷正戊烷0.00.231.358195 正己烷正己烷0.3131.375190 四氯化

11、碳四氯化碳0.140.9651.46265 苯苯0.250.651.501280 氯仿氯仿0.260.571.443245 水水1.001.333170 2. 2. 荧光检测器荧光检测器(FD) (1) 检测原理检测原理 根据物质受激发后能产生一定根据物质受激发后能产生一定 强度的荧光与被分析物的含量有关强度的荧光与被分析物的含量有关 制成的检测器。制成的检测器。 (2) 优点优点 n(1) 灵敏度极高的浓度型检测器，灵敏度极高的浓度型检测器， n 其灵敏度比其灵敏度比UV检测器高检测器高23个数量级，个数量级， n(2) 选择性极好选择性极好, n(3) 最低检出限可达最低检出限可达10-1

12、2g.mL-1, n(4) 专用型检测器，只对能产生荧光的物质有响应，专用型检测器，只对能产生荧光的物质有响应， n(5) 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 n 主要用于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、主要用于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、 色素、蛋白质等荧光物质的测定。色素、蛋白质等荧光物质的测定。 3.3.示差折光检测器示差折光检测器(RID) (1) 原理原理 n 依据不同性质的溶液对光具有不同的依据不同性质的溶液对光具有不同的折射折射 率率而建立的检测方法。而建立的检测方法。 n 通过连续测量溶液折射率的变化可测知各通过连续测量溶液折射率的变化可测知各 组分的含量

13、。组分的含量。 光源光源 调零调零光学零光学零 参比参比 样品样品平面镜平面镜 透镜透镜 光电转换光电转换 记录仪记录仪 放大器放大器 遮光板遮光板 图图5-10 示差折光检测器示差折光检测器 n 溶液的折射率等于纯溶剂溶液的折射率等于纯溶剂(流动相流动相)和溶质和溶质 (试样组分试样组分)的折射率乘以各自的质量分数之和。的折射率乘以各自的质量分数之和。 (2) 优点优点 n(1) 通用型检测器，凡是与流动相折射率通用型检测器，凡是与流动相折射率 不同的组分均可进行检测。不同的组分均可进行检测。 n(2) 灵敏度较低的浓度型检测器，灵敏度较低的浓度型检测器， n(3) 对温度和流速变化敏感，对

14、温度和流速变化敏感， n(4) 不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。 4. 4.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器(ELSD) n 是基于光线通过被分离组分的微小的粒子时会产是基于光线通过被分离组分的微小的粒子时会产 生光散射现象的原理设计的。生光散射现象的原理设计的。 n 经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化室，被高经色谱柱分离的组分随流动相进入雾化室，被高 速的惰性载气喷成细小雾滴后进入蒸发器，流动相在速的惰性载气喷成细小雾滴后进入蒸发器，流动相在 高温被蒸发，剩下溶质颗粒，通过光路，产生的散射高温被蒸发，剩下溶质颗粒，通过光路，产生的散射 光由光电倍增管采集放大得到试样信号。光由光电倍增管采

15、集放大得到试样信号。 (1) 原理原理 (2) 优点优点 n(1) 灵敏度较高的质量型检测器，灵敏度较高的质量型检测器， 灵敏度比示差折光检测器高。灵敏度比示差折光检测器高。 n(2) 通用型检测器，通用型检测器， n(3) 检测挥发性低于流动相的样品，检测挥发性低于流动相的样品， n(4) 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 5. 5.电化学检测器电化学检测器 n 具有电化学氧化还原性质的化合物流经具有电化学氧化还原性质的化合物流经 检测器发生电解，产生的电信号经放大而被检测器发生电解，产生的电信号经放大而被 检测。检测。 n 主要适用于能导电的有电活性的硝基、主要适用于能导电的有电活性的硝基

16、、 氨基等基团的有机物的检测。氨基等基团的有机物的检测。 (1) 原理原理 (2) 优点优点 n(1) 高灵敏度浓度型检测器，高灵敏度浓度型检测器， n(2) 只适合具有氧化还原性质的物质。只适合具有氧化还原性质的物质。 n(3) 最低检出限可达最低检出限可达10-9g.mL-1, n(4) 不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。 (3) 缺点缺点 n 发生氧化还原反应的电极表面发生氧化还原反应的电极表面 容易被蛋白质、表面活性剂等物质容易被蛋白质、表面活性剂等物质 毒化，使氧化还原反应效率变差。毒化，使氧化还原反应效率变差。 (4) 分类分类 n分四类：分四类： n 电导检测器电导检测器 n 库伦检测器库伦检测器 n 伏安检测器伏安检测器 n 安培检测器安培检测器 应用最广应用最广 6. 6.质谱检测器质谱检测器 n 组分分离后进入质谱仪，在质谱仪中首组分分离后进入质谱仪，在质谱仪中首 先被离子化，再在加速电压作用下进入质量先被离子化，再在加速电压作用下进入质量 分析器进行质量分离，分离后按质量大小记分析器进行质量分离，分离后按质量大小记 录质谱图，最后，根