植物的组织培养

1、实验一植物的组织培养 实验原理实验原理 植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或细 胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和 植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分 化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具 有全能性。 组织培养的特点是：组织培养的特点是：取材少，培养材料经 济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生 长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控 制。组织培养不但是进行细胞学、遗传学、育种 学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段； 而且在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等 生产领域得到广泛的应用。 培养基是植物组织培养中的主要部分培养基是植物组织培养中的主

2、要部分， 除了培养材料本身因素外，培养基的种类和 成分等直接影响培养材料的生长和发育，应 根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的 培养基。培养基的种类很多，不同的培养基 有其不同的特点。 培养基的主要成分： 水 无机成分： 无机大量元素 氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、硫、镁 无机微量元素 主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯 有机成分： 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。 植物生长调节物质： 生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333 琼脂 pH值 配制培养基最方便的方法是

3、预先配制不同组分 的培养基母液，贮藏在冰箱，待配制培养基时取出， 按比例稀释。 配制母液时为了减少工作量可以把几种药品配 在同一母液中，但是应该注意各种化合物的组合以 及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、钡离 子和硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。 把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。 混合已溶解的各种矿质盐时还应该注意加样顺序。 铁盐单独配制，其配法为5.57g 的硫酸亚铁（Fe SO4.7H2O）和7.45g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶于 1L水中，用时每配1L培养基，取该溶液5ml。 IAA 、IBA、NAA等可用少量的乙醇溶解，然后在加 水定容。2,4-D可用1

4、N的Na OH 溶解然后再定容； KT和 6-BA应先定容于少量的1 mol/L 的HCl中，再加水定容。 玉米素应该溶于95% 的乙醇中再定容。 pH值对培养基的凝固情况和植物材料的生长有很大的 影响，因此，等培养基配好后，应该立即调整培养基的 pH ,最好用酸度计，既快又准。培养基配好后应该立即分 装，体积一般为容器的 1/4 或者1/3为好。 器材和药品器材和药品 高压蒸汽灭菌锅、洁净工作台、循环水式真高压蒸汽灭菌锅、洁净工作台、循环水式真 空泵、电子天平、酸度测定仪、光照培养箱空泵、电子天平、酸度测定仪、光照培养箱,搪搪 瓷杯、搪瓷盘、瓷杯、搪瓷盘、100 ml三角烧瓶（三角烧瓶（12

5、个个/组）、组）、 250 ml三角瓶（三角瓶（2个个/组）、试剂瓶、解剖刀柄与组）、试剂瓶、解剖刀柄与 刀片、单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移刀片、单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移 液管、漏斗、量筒、烧杯（液管、漏斗、量筒、烧杯（50、100、500、 1000 m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、 封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮筋、脱脂棉、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮筋、脱脂棉、 滤纸、滤纸、pH试纸（试纸（5.4-7.0）、标签纸、称量纸、）、标签纸、称量纸、 药勺等。药勺等。 次氯酸钠消毒液次氯酸钠消毒液, 75%的酒精的酒精 ,0.2的升汞溶液的

6、升汞溶液. 1 N 盐酸盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂的琼脂,3%的蔗糖的蔗糖. 0.1 mg/ml的的2,4-D溶液溶液：取25 mg的 2,4-D，加入 少量95%的酒精和1 N的NaOH溶解，再加蒸馏水 定容至250 ml。 0.1 mg/ml 的的6-BA溶液溶液：取25 mg的6-BA，用少 量1 N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250 ml。 表.1 MS培养基储备液的配制培养基储备液的配制 实实验步骤实验步骤 P培养基的配制培养基的配制 11母液配制：母液配制： 按照表 1分别配制，并在4 冰箱中保存。 22. 植物激素配制植物激素配制：称取10 mg NAA,加入少量酒精

7、，并加水定 容50 ml (浓度为0.2 mg/ml), 用同样的方法配制2，4-D母液。 称取 50 mg 6-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至 50 ml (浓度为1 mg/ml) 。 4 3MS基本培养基的配制基本培养基的配制：分别吸取MS贮备液30.0 ml（ 大量元素）、3.0 ml微量元素、 3.0 ml铁盐、 3.0 ml有机, 加入1 L的搪瓷缸中，然后称取蔗糖18.0g, 加入琼脂4.8g ，加蒸馏水约550 ml，在电炉上加热，煮沸，融化琼脂 ，然后加水至560ml。 4. 不同激素浓度培养基的配制不同激素浓度培养基的配制：取200ml烧杯3

8、个，分别 吸取所需要的2,4-D溶液(0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 所需要的 体积为：1.0，2.0, 4.0ml)，然后加入MS基本培养190ml， 搅拌均匀后，用10%的NaOH调节pH至5.8。 加水定容至 200ml。 5. 将配制好的培养基分装于50ml三角瓶中，盖上封口膜， 并用牛皮纸包扎。 操培养基灭菌 11. 打开灭菌锅盖，向锅内加水。 22.加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多， 以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺 壁流入物品中。 33. 加盖旋紧螺旋。 44. 打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关 紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由

9、排气孔排尽，让温度 随蒸汽压力的增高而上升。 5 5. 待压力逐渐上升到所需压力时（待压力逐渐上升到所需压力时（一般为一般为15磅磅/时，时， 1.03410 5Pa）, 灭菌灭菌20分钟。分钟。 6 灭菌后，灭菌后，待压力降至待压力降至0时，时，开盖，取出灭菌物品。开盖，取出灭菌物品。 （在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。 胡萝卜组织培养胡萝卜组织培养 1. 取两个50ml的小烧杯,分别倒入25ml的70%的酒精和 0.2%的升汞。 2. 取胡萝卜贮藏根，洗净，然后将胡萝卜根于70酒 精中浸泡数秒钟。 3. 浸于0.2氯化汞（升汞）液中消毒灭菌10 m

10、in后,再 用无菌水冲洗34次。 4. 将灭菌材料放在灭菌的滤纸上,吸干水分。 5. 用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层，切成 0.5cm见方的小块，接种于MS附加 2.0mg/L 2，4-D 培养基内,于 25，黑暗或漫射光下培养,1421 天 后继代一次。 水稻成熟胚组织培养水稻成熟胚组织培养 1. 取成熟种子，用 70乙醇浸l min，转至l.5次氯酸钠溶 液（ 含有0.01%吐温20）浸泡l.52 h后，用无菌水冲洗4 5次，置无菌滤纸上吸干多余水分。 2. 将成熟胚置于含 2 mgL 2，4D的 MS固体培养基上， 27 暗培养诱导愈伤组织 10天后（成熟胚）继代一次。 注意事项

11、：注意事项： 配制培养基时，一定要注意调节配制培养基时，一定要注意调节pH。 2.外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。 结果结果 外植体经过外植体经过20天的培养后，长出淡黄色的愈伤天的培养后，长出淡黄色的愈伤 组织。组织。 花卉组培苗产业花卉组培苗产业 化现状与前景化现状与前景 绪论 当今，植物生物技术已发展成为新技术革命 的重要组成部分，在农业、林业、园林等领域运 用生物技术收到了巨大的经济效益和社会效益， 其中组织培养工厂化育苗是运用最广、效果最好 的一项。组织培养快速繁殖种苗，具有无性繁殖 的特点，能较好地保持原种的优良经济性状，繁 殖系

12、数高，便于工厂化生产和集约化经营，以组 织培养快速繁殖技术为手段建立某种或某类植物 商业性地生产体系，被誉为最具有开发前景地种 苗产业。 一、国内外花卉组培苗产业化发、国内外花卉组培苗产业化发 展动态展动态 1.1国外花卉组培苗产业化概况 1960年法国的莫瑞尔（Morel）建立的兰花 组培苗工厂，标志着世界上第一家花卉组 培苗实现规模化生产. 进入80年代以后，花卉组培苗产业化生产 得到了较快的发展。据欧洲及地中海植物 保护组织（EPPO）1991年公报，仅西欧 国家目前共拥有248家植物繁殖公司，其中 从事花卉组培苗生产的占有较大的比重。 1.2国内花卉组培苗产业化概况国内花卉组培苗产业化

13、概况 在我国农业、林业、园林等领域里，国家级、 省级、甚至市级、县级的科研单位、大专院 校等几乎都拥有植物组培的实验室或繁殖中 心或育苗工厂或育苗公司 广州花卉研究中心工厂化生产荫生观叶植物 组培苗年产量达千万株以上 浙江亚林所已大量培养唐菖蒲脱毒苗 上海多个科研院所或生产单位培育的香石竹、 勿忘我、扶郎花等组培苗已大批量地推上市 场，有的还外销，年产量达100万株以上 上海交大昂立天然药物工程技术有限公司 目前已开展了铁皮石斛新采集野生蒴果的 组织培养工作。组培苗长势良好，预计年 底可生产100万株苗，并完成10 亩大田的 移栽工作。明年即可得到人工栽培的濒危 珍稀药材铁皮枫斗。 铁皮石斛组

14、培苗 铁皮石斛组培苗 二、我国花卉组培苗产业化现 状 我国农业生物技术工作者对3000多种植物 进行了组培最佳培养基的筛选工作,但真正 应用于大规模产业化的组培植物主要是果树 类作物及一些经济作物,全国已建成葡萄、 苹果、香蕉、马铃薯、甘蔗等快繁生产线11 条,供应试管苗达几千万株,生产的香蕉已进 入国际市场。 目前花卉组培苗产业化发展较快的主要有香 石竹、百合、大花惠兰、马蹄莲的组培苗也 在向产业化方向发展,但规模较小。 三、我国花卉组培苗产业化存在存在 问题问题 1、培养程序过于繁琐、培养程序过于繁琐,成本高成本高,科研成果不科研成果不 易向产业化方向发展易向产业化方向发展 唐菖蒲用花蕾外

15、植体建立脱毒苗后,需分别继 代于分化培养基和生根培养基,分化培养基中 必须附加NAA、6-BA和腺嘌呤,生根培养基中 须附加IBA,培养周期为65天左右。 脱毒微型薯在基本MS培养基中既能生长茎叶 又能生根,不需要外加激素,培养周期为20天左 右,生产工艺程序简单、生产成本低。 这就是脱毒微型薯组培容易形成产业化,而兰 花、唐菖蒲等花卉不易形成产业化发展的原因 之一。 2、同一种花卉不同属、不同品种所、同一种花卉不同属、不同品种所 用培养基不相同用培养基不相同,重现性差重现性差 国内外学者对卡特利亚兰组培苗的研究： 美国学者认为卡特利亚兰茎尖或只带一对叶原 基的茎尖分生组织在Knudsonc附

16、加100mgL- 1椰奶液体培养基中培养效果最佳。 中国学者认为MS附加6-BA5mgL- 1,NAA0.1mgL-1固 体培养基中培养增殖效果最佳。 其他学者也做过这方面研究,结果不尽相同 。 归结原因主要是不同品种的外植体培养方法不 同,重现性差 。 3、组培苗移栽成活率差、开花难、组培苗移栽成活率差、开花难 天津绿化研究所成功地研究出大花惠兰组 培苗培养基配方和小苗的移栽方法,但对大 花惠兰的开花生理没有完全了解,栽培方法 掌握不好,成苗后不能开花,他们与南韩合作, 所生产的组培盆栽成活后,由韩国栽培开花。 4、花卉市场运转不良是阻碍花卉组、花卉市场运转不良是阻碍花卉组 培产业化发展的主

17、要原因培产业化发展的主要原因 不仅农业生物技术产业化发展受到市场 的限制,其它高科技发展和推广同样受到市 场的挑战。这给我们科技工作者提出了怎 样以市场为导向,努力探索加快我国现有生 物技术成果转化为生产力,并使产业形成一 定规模的新途径。 四、我国花卉组培苗产业化发展四、我国花卉组培苗产业化发展 前景及建议前景及建议 1、简化培养程序,降低生产成本,形成 产业化配套体系 尽可能探索一次性成苗的最佳培养基配方, 减少移苗次数,缩短培养周期 尽量减少生长调节素的种类和用量,简化操 作程序 掌握从准备制备培养基分装灭菌 接种培养移栽的一整套简化程序的工 艺流程 尽量增加每瓶接苗数,降低生产成本 2、增加收入,有计划地采用先进设备 和技术 荷兰在短短几十年内成为驰名世界的“花 卉王国”的经验之一就是他们重视选育良 种,采用技术先进、系列配套的设施以及普 遍推广高新技术 目前我国花卉组培种苗的培育规模比较小, 为了促进花卉业的发展,应适当增加投入,引