第八章环境工程微生物学-微生物的遗传和变异3

1、主要内容主要内容 l 微生物的遗传与环境工程(重点) l 微生物的变异 l 基因重组 l 遗传工程技术在环保中的应用(重点) 微生物的遗传变异与环境工程 微生物的遗传 l 遗传和变异是一切生物最本质的属性。是 指亲代如何如将自身的遗传基因稳定地传 递给下一代的特性。 l 遗传（保守性/相对性） l 变异（绝对性）育种/废水（气、固废） 降解菌的筛选 l 遗传和变异进化 l 遗传学：研究生物遗传和变异现象的学科。 一、概述 微生物的遗传 l 遗传和变异的物质基础DNA l DNA的结构与复制 l DNA的变性和复性 l RNA的类型和结构 l 蛋白质的合成 微生物的遗传 1、遗传和变异的物质基础

2、核酸（DNA，RNA） 三个经典实验 （一）经典转化实验（transformation）： （二）噬菌体感染实验 （三）植物病毒的重建实验 经典转化实验 S S R R 噬菌体感染实验 噬菌体噬菌体 1952.赫尔希和切斯 l 1952年 l 赫尔希和切斯 l 噬菌体侵染 大肠杆菌实验 噬菌体感染实验 为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat （1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进 行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其 蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA 在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使 其患典型症状，而且

3、在病斑中还能分离出正常病 毒粒子。 植物病毒的重建实验 遗传物质在细胞中分布 染色体（染色体（DNADNA和蛋白和蛋白） 核苷酸的结构 （二）DNA的化学结构和模型 一分子磷酸 一分子含氮碱基 一分子脱氧核糖 四种碱基 A（腺嘌呤） T（胸腺嘧啶） G（鸟嘌呤） C（胞嘧啶） 1、DNA的化学结构 DNA分子结构，是通 过3,5-磷酸二酯键连 接形成线性或环形多 聚体。由于组成DNA 的核苷酸彼此之间的 差别仅在于碱基部分， 所以DNA的化学结构 即指DNA分子中碱基 的组成和排列顺序。 1、DNA的结构 1、DNA的结构 AT,GC互相间通过 氢键连接。 2、DNA的模型 1.DNA分子是由

4、两条反向平行的多核苷酸链围 绕同一中心轴相互缠绕构成的，两条线都 是右手螺旋。 2.磷酸与核糖在外侧，通过3,5-磷酸二酯键 线连接形成DNA分子骨架，嘌呤碱基与嘧 啶碱基位于双螺旋的内侧。 3.双螺旋的平均直径为2 nm，两个临近的碱 基对之间距离为0.34 nm，沿中心轴每旋转 一周有10个核苷酸，因此，每一转的高度 为3.4 nm。 4.两条核苷酸链通过碱基之间的氢键相连。 （二）DNA的化学结构和模型 1953年的克里克（Francis Crick,1916-2004)（右）和沃森(James Watson,1928-)在实验室里，他们两人因为发现了DNA的分子结构， 而在1962年与

5、威尔金斯一起获得诺贝尔生理学和医学奖。 （三）RNA的类型与功能 RNA的化学结构主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四种 核糖核苷酸通过3,5-磷酸二酯键相连而成的多聚和苷酸链。 天然RNA的二级结构只在许多区段发生自身回折，使部分 A-U，G-C碱基配对，形成短的、不规则的螺旋区。不配 对的碱基区膨出形成环，被排斥在双螺旋之外。 RNA的分类 核糖体RNA（r RNA ）、信使RNA（mRNA ）和转移 RNA （ tRNA ）反义RNA（asRNA)。 反义RNA起调节作用，决定mRNA翻译合成速度。 由mRNA、tRNA、反义RNA和rRNA协作合成蛋白质。 DNA分子的四种碱基 A

6、（腺嘌呤） T（胸腺嘧啶） G（鸟嘌呤） C（胞嘧啶） RNA分子的四种碱基 A（腺嘌呤） U（尿嘧啶） G（鸟嘌呤） C（胞嘧啶） （三）RNA的类型与功能 （一）DNA的复制-自我复制 1、DNA的半保留复制 DNA具有独特的半保留式的自我复制能力，确保了DNA 复制精确，并保证一切生物遗传性的相对稳定。 二、DNA的复制与蛋白质的合成 2. DNA的复制过程 1）DNA复制的起始 （1）DNA复制的起始点 DNA复制开始于染色体上的特定部位，成为起始点。在起始点处双股 螺旋解开成单链状态，各自作为模板按照互补配对原则吸引带有互补 碱基的核苷酸，合成其互补链。在起始点处出现叉子状的生长点，

7、成 为复制叉。 (2) DNA复制的方向 复制的方向有三种：一是从两个起点开始，各以相反的单一方向生长 出一条新链，形成两个复制叉；二是从一个起始点开始，以同一方向 生出两条链，形成一个复制叉；三是从一个起点开始，沿两个相反的 方向各生长出两条链，形成两个复制叉。 （3）RNA引物的合成。 DNA聚合酶只能催化链的延长不能发动新链合成，即它需要一个具3- OH的核酸链作为引物，才能将合成原料dNTP一个个接上去。RNA引 物酶则不同，此酶以DNA为模板就可以合成一段新的RNA，这段 RNA作为合成DNA的引物。DNA聚合酶从该引物3-OH端开始合成新 的DNA链。 2）DNA复制的延长和终止

8、所有已知DNA聚合酶都只是能催化5 3方向的合成 2. DNA的复制过程 3、DNA聚合反应的相关酶 （1）解旋酶 （2）DNA聚合酶 （3）DNA连接酶 （4）拓扑异构酶 能使细胞中游离的四种脱氧核糖核苷三磷酸 （dATP,dCTP,dTTP.dGTP）合成DNA (有适量DNA和Mg2+)； 性质：模板指导性的酶 5-3 产物DNA和天然的DNA性质相同 二、DNA的复制与蛋白质的合成 复制 酶解开母体的 双螺旋结构 蛋白质固定已展开 的DNA母体 DNA聚合酶 复制叉（起始点） 重要的一股链通过 DNA聚合酶继续被 合成 母链 RNA引物 冈崎片段 DNA不连续复制产生的长约 12kb的

9、片段，随后共价连 接成完整的单链 DNA连接酶 后随链 随从链DNA复制时双螺旋的两股单链走向相反， 从3，5的模板链只是解开一定长度时，子链才 能从5，3的方向开始形复制，这股不能连续复 制的链成为随从链。 DNA酶消化RNA引物 然后，DNA代替它 中心法则是指遗传信息从DNA传递到RNA，再从RNA传递给蛋白质， 即完成遗传信息的转录和翻译过程。遗传信息也可以从DNA传递给 DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有具有细胞结构的生物所遵循 的法则。 1.遗传的中心法则和发展 遗传信息通过DNA的复制和蛋白质的表达完成的 （二）蛋白质的合成 在细胞核中，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补

10、 配对的原则合成RNA的过程，称为转录。 2 转录 DNA的平面结构图 AG T AC A A A T TCATG T TT A AG T AC A A A T A G C U G A C G G U U U DNA模板信息链 游离的核糖核苷酸 2 转录 AG T AC A A A T A G C U G A C G G U U U RNA 聚合酶聚合酶 AG T AC A A A T A G C G A C G G U U U U AG T AC A A A T A G C G A C G G U U U U AG T AC A A A T G C G A C G G U U U U A A

11、G T AC A A A T G C G A C G U U GU UA AG T AC A A A T G C G A C G U GU UAU AG T AC A A A T G C G A C G GU UAU U AG T AC A A A T G C G A C G GU UAU UA AG T AC A A A T G C G C G GU UAU UA U AG T AC A A A T G G C G GU UAU UA U C AG T AC A A A T G G C G GU UAU UA U C mRNA 1.定义：游离在细胞质中的各种氨基酸，以mRNA为模板，合 成具

12、有一定氨基酸排序的蛋白质的过程，称为翻译。 2、遗传密码：、遗传密码： mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基叫做密码子。 密码子密码子 UCAUG A UUA mRNA 密码子密码子 密码子密码子 从遗传密码表中可看出： 密码子共64种。其中二个起始密码（AUG、GUG）；三个终 止密码（UAA、UAG、UGA）不决定任何氨基酸。 一种密码子只对应一种氨基酸，但一种氨基酸可以和多种密 码子相对应。 转运RNA：分子结 构呈三叶草形，其一端 能与一个特定的氨基酸 结合，另一端有三个特 殊的碱基，能与mRNA 上的“密码子”相互配 对，称为“反密码 子” 。反密码子的种 类：61种。 AC U

13、 天冬 氨酸 反密码子 AUG 异亮 氨酸 反密码子 4、 翻 译 过 程 A U G G AUA U C ？ 甲硫氨酸 CUA 反密码子 密码子 UCAUG A UUA AA U 亮氨酸 AC U 天门冬 氨酸 核糖体 UCAUG A UUA AA U 亮氨酸 AC U 天门冬 氨酸 UCAUGAUUA AAU 亮氨酸 ACU 天门冬 氨酸 AUG 异亮氨酸 UCAUGAUUA AAU 亮氨酸 ACU 天门冬 氨酸 AUG 异亮氨酸 肽键 UCAUG A UUA AA U 亮氨酸 AC U 天门冬 氨酸 AUG 异亮氨酸 UCAUGAUUA AAU 亮氨酸 ACU 天门冬 氨酸 AUG 异亮

14、氨酸 肽键 UCAUG A UUA A A U 亮氨酸 AC U 天门冬 氨酸 AUG 异亮氨酸 UCAUG A UUA AA U AC U AUG 亮氨酸 天门冬 氨酸 异亮氨酸 肽链 翻 译 小 结 场所: 模板: 原料: 条件: 产物: 原则: 细胞质的核糖体上 以信使RNA为模板 二十种氨基酸 需要酶和ATP 多个多肽或蛋白质 密码子与反密码子配对,既碱基 互补配对原则（A=U，G=C） 肽链合成完毕后，一条或几条肽链通过一定的空间构建方 式组成一种或多种具有特定空间结构的蛋白质，从而表现出生 物体特定的性状。 3.翻译 DNA（基因）的遗传信息 mRNA的遗传信息 蛋白质的氨基酸排列

15、顺序 氨基酸的个数n 碱基至少3n 碱基至少6n 4、基因控制合成蛋白质的全过程 基因指导蛋白质合成的全过程 lDNA的变性： l解链温度Tm： lDNA的复性： 三、DNA的变性和复性 DNA的变性 DNA复性 四、分子生物学技术及其在环境工程中的应用 目前，用于环境工程的分子生物学技术的基因序列主要 有3种 1).编码蛋白的基因序列。主要 包括污染物的降解基因以及和微生物分类 有关的基因。 2).rRNA基因序列。原核微生物的分类对16S rRNA研究最多。 3）16S-23SrRNA基因转录间隔区。 （一）.常用的分子生物学技术 聚合酶链式反应技术（PCR） 是一种在体外快速扩增特定基因

16、或DNA序列的方法，故又 称为基因的体外扩增法。 一、PCR基本原理 PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA 复制过程。 依据DNA半保留复制的机理。 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。 四、分子生物学技术及其在环境工程中的应用 细胞内复制的过程 1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链， 各自作为模板。 2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3- OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照 碱基配对的原则，从引物的3端，循53方向，将脱氧 核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。 四、分子生物学技术及其在环境工程中

17、的应用 Denaturing 95C Annealing Tm-5C Extension 72C PCR的原理 四、分子生物学技术及其在环境工程中的应用 PCR的基本过程 1.变性：将反应体系升温至95左右，样品中双链DNA解开成 两条单链，各自作为模板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。 2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55左右)，5端和3端 的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。 5 5 3 3 编码链 3端引物5端引物 3 3 3. 延伸：将温度升到75左右，耐热的Taq DNA聚合酶催 化四种 dNTP，从引物3-OH端开始，依据模板碱基序 列互补方式依次聚合，合成一条互补

18、的DNA链。 5 5 3 3 5 DNA聚合酶 5 PCR的基本过程 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量可以 扩大100万倍以上。 PCR产物的鉴定、提取 琼脂糖凝胶电泳 四、分子生物学技术及其在环境工程中的应用 PCR的扩增效应 理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA 量可成指数(2n)增加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为(1+X)n。 一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加 106 倍。 四、分子生物学技术及其在环境工程中的应用 2.核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术

19、是一种基于DNA分子碱基互补配对原则， 用特异性的探针与待测样品进行杂交来检测目的基因的技 术。 其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件 下可按碱基互补形成双链，此杂过程是高度特异性的，杂 交的双方是已知核酸片段的探针及待测核酸序列。 常用的几种杂交技术 1. 斑点印迹 2.Southern杂交和Northern杂交 3.原位杂交技术 3. 以rRNA基因为基础的细菌同源性分析 rRNA基因为基础的同源性分析方法，是综合应用多项分 子生物学技术对细菌中rRNA基因进行分析，从而对微生 物进行鉴定和多样性分析的一种技术。 4.电泳技术 变性梯度凝胶电泳（DGGE） 该技术可以分离长度

20、相同而序列不同的DNA片段混合物， 分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙酰胺凝胶电泳更高，甚至可 以检测到一个核苷酸水平的差异。 （二）常见分子生物学技术在环境工程的应用（略） 第二节 微生物的变异与环境工程 变异的实质 在微生物遗传过程中，由于某种因素的影响，DNA上的碱基 对发生差错，出现碱基的缺失、置换或插入，改变了基因内 原有的碱基顺序，导致后代性状的改变。当这种改变可以遗 传时，就是发生了突变。所以说基因突变是微生物发生变异 的实质。 一、突变类型和基因符号 （一）突变的类型 突变就是遗传物质在核苷酸序列发生了可以遗传的改变。 主要包括基因突变和染色体畸变。 1. 基因突变 基因中DNA序列的

21、任何改变，包括一对或少数几对碱基的 改变而导致的遗传变化成为基因突变。 2.染色体畸变 染色体畸变不仅包括染色体结构的缺失、重复、插入、倒 位和易位，也包括染色体数目的改变。 （二）基因符号 略 第二节 微生物的变异与环境工程 二、基因突变的原因 突变的类型 自发突变 诱发突变 l 物理诱变，如紫外线。 l 化学诱变，利用化学物质促进突变。 紫外线的作用机理：形成T的二聚体， 从而导致DNA复制出现错误。 光复活性： 核苷酸切除修复酶 遗传病、癌症 第二节 微生物的变异与环境工程 三、基因突变在环境工程中的应用 （一）从自然界中获取新菌种 新的微生物菌种需要不断地从自然生态环境混杂的微生 物中

22、挑选出来。菌种的筛选过程大体可分为采样、增殖、 纯化和性能测定等步骤。 （二）定向培育和驯化 定向培育是一种利用微生物的自发突变，人为用某一特定 环境条件长期处理某微生物群体，同时通过对微生物群体 不断移植以选育出优良菌株的方法。 长时间的定向培育在环境工程中被称为驯化。 第二节 微生物的变异与环境工程 （三）诱变育种 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理微生物细胞群，在显著 提高其突变率的基础上，采用一定的筛选方法获得少数符合要求的 突变株。 其中，诱变和筛选时诱变育种过程中的两个主要环节。 诱变的主要步骤 1.选择简便有效的诱变剂 ； 2.挑选优良的出发菌株； 3.处理单细胞或単孢子悬液

23、； 4.选用最适的诱变剂量； 5.充分利用复合处理的协同效应； 6.创造和利用形态、生理与产量 间的相关关系； 7.筛选方案。 第二节 微生物的变异与环境工程 三、基因重组 基因重组是改变微生物遗传性状的另一途径。把来自不 同性状的个体细胞的遗传物质转移到一起，使基因重 新组合，产生新品种，称为基因重组或遗传重组。 重组是分子水平上的一个概念，可以理解为遗传物质分 子水平的杂交。 原核微生物的基因重组形式主要有转化、转导和接合等 第三节 基因重组 基因工程基因工程 基因工程过程示意图 剪切酶 连接酶 修饰酶 质粒 (plasmid ) Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 P

24、lasmid chromosome 第四节 质粒及其应用 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、 并被稳定遗传的一类核酸分子 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构， 即cccDNA 质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是DNA型的 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb 质粒的基本特征 质粒的基本特征 质粒的自主复制性 质粒的不相容性 质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记 质粒的自主复制性 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 2 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent pla

25、smid 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时 存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性， 不相容性的质粒组成不相容性群 质粒的不相容性 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一 个细胞（接合作用） 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存 在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决 定。 质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得 寄主生物产生正常生长非必需的附加性状 物质

26、抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 载体（vector） ，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目 的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。三种 最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。 质粒应用 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 载体的功能 （1）具有复制起点 （2）具有抗菌素抗生基因； （3）具若干限制酶单一识别位点； （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数 克隆载体具备的条件： 克隆载体：在载体上插入合适大小的

27、外源DNA片段，并注意不能 破坏载体的自我复制性质，将重组后的载体引入到宿主细胞中， 并在宿主细胞中大量繁殖。 克隆载体 表达载体（Expression vectors）：在克隆载体基本骨架的基础 上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能 够表达的载体。 表达载体 表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因 (1)分子量尽量小，大于15kb 时转化效率低。 (2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。 (3)包含可供选择的标记性状(基因) (4)应有另一个遗传标记基因（抗生素常用）， (5)最大限度地具有MCS的单切点 构建质粒载体 Vector Target DNA Recombinant plasmid/DNA Clone DNA Cloning 第五节遗传工程技术在环境工程中的应用 （1 1）石油石油降解功能菌的构建降解功能菌的构建 （2 2）烃类和抗汞烃类和抗汞质粒菌的构建质粒菌的构建 （3 3）脱色工程菌脱色工程菌的构建的构建 （4 4）特殊环境特殊环境下的下的Q5TQ5T工程菌的构建