小鼠肿瘤模型

1、肿瘤模型我们一般常用的就是小鼠模型和人肿瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型， 另外还有腹水（或者尾静脉注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他们了。小鼠模型分三大类：第一类是以 S180、EAC、H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用KM，可产生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下接种构建模型，接踵后 第二天开始给药，给药 7到10 天，接种 10天后结束试验，剥取肿瘤称瘤重。1. 关于构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用 PBS悬浮至13Xl06/mouse，接种即可，最好用 6号左右的针头，就是常用的 2ml 一次性注射的针头。2. 关于腹水

2、传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89 天左右），可以传代，传代时取 1ml 注射器，用 2ml注射器的针头，种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点， 还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽个就可以了，不用离心，直接用PBS36 倍稀释后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不 好，需要注意调整，第二代以后，尽量 67 天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性。三代 后可用于试验。3. 关于接种进行试验这个时候抽取的腹水需要量比较多，一般需要处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥

3、开腹部皮 肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面有倒勾的镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的 肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后进过一定的稀释后， 接种到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始的时候可以适当的计 数，但是要用台盼兰染色后计活细胞数。接种部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有的人接种的时候 喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往里走，然后注射的时候感觉阻力较大，打出来的皮丘又紧又圆，这样的 接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连

4、，不利于最后肿瘤的剥取。也不要紧靠肌肉，肿瘤会与肌肉严重粘连。应 该在两者之间，进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不会很圆很漂亮，但是相对好剥取 一些。 O4. 关于观测指标主要是按时称体重，试验结束后剥取肿瘤称瘤重。因为出瘤已经是接种后的第 6 天左右了，第 10 天 就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很难剥，这是没有办法的，只能耐心，没有太好的办法， 剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。肿瘤组织周围 经常会有一些血窦的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出，正常的，但是剥瘤子的时候不要把它弄破， 会严重影响瘤重。按照 SFDA

5、 的规定，平均瘤重小于 1g ，或者单个瘤重小于 200mg ，认为肿瘤生长不良， 试验作废。小鼠模型第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为C57。不产生腹水，只能皮下生长。 多用插块法或者匀浆法传代和接种做试验。有一种做法也是接种后第二天开始给药，还有一种做法是接种 三天后给药，接种后两周结束试验，剥取肿瘤称重。1. 关于瘤种构建体外细胞株，培养后 PBS悬浮至13X 106/site，接种至小鼠腋下，即可。2. 关于传代与接种剥取肿瘤，在 PBS 中取出肿瘤表面包膜和中心的坏死部分，剪刀剪成小块，小块大小以套管针的针 口为标准。用镊子将小块从针头处塞进 1820 号的套管

6、针，接种至小鼠腋下，用套管针中间的实体针将瘤还可以在上述肿瘤组织剪成小块后， 用玻璃匀浆器匀浆后， 200 目筛网过滤， 收集滤液， 活细胞计数， PBS 稀释后用注射器接种，稀释量也需要各个实验室自己摸索。也是三代后可用于试验。3. 关于观测指标可以在出瘤后测量瘤体积，但是主要还是考察瘤重。小鼠模型第三类是以 P388 、L1210 为代表的白血病模型。宿主为 DBA2 ，也有人用 C57 与 DBA2 的 F1 代传代， DBA2 用于试验，但是我们两种宿主都传过代，没有发现有什么区别。他们能形成腹水，一 般不用于皮下接种试验，平时多用腹水传代，实验时多用腹腔接种或尾静脉接种考察生存时间。

7、也是接种 后第二天开始给药这个就不细说了，很多可以参考第一类，主要几点就是，他们的腹水都是血性的。另外，腹水量也不多， 有的时候可以先注射一到两毫升的 PBS 后，再抽取。肿瘤模型构建小鼠模型分三大类第一类是以S180 EAG H22等为代表的，他们的宿主小鼠多选用 KM可产生 腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水传代，实验时抽取腹水，经过一定稀释后皮下 接种构建模型， 接种后第二天开始给药 （这里与指导原则相悖， 指导原则要求肿 瘤长至 100-300 立方毫米时才给药），给药 7 到10 天，接种 10 天后结束试验， 剥取肿瘤称瘤重。1. 构建瘤种可以用体外细胞株培养后，用 PBS悬浮至13X

8、 106/mouse,接种即可，最好用 6号左右的针头，就是常用的 2ml 一次性注射的针头。细胞悬液接种时要选活力 好的细胞，就是对数期。细胞生长至瓶底 7080%满的时候认为是对数生长期。2. 腹水传代观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约 89 天左右），可以传代，传代 时取 1ml 注射器，用 2ml 注射器的针头， 种鼠腹部消毒后直接将针头插入抽取腹 水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重 力，让腹水集中在某处便于抽取， 一般抽个就可以了， 不用离心， 直接用 PBS36 倍稀释后， 接种到新的老鼠腹腔， 腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的， 但 是血

9、性腹水说明不好，需要注意调整。第二代以后，尽量 67 天的时 候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易 血性。三代后可用于试验。腹水瘤接种时，接种量不要太高，1*107/ml ，即可，多按 1：3 用生理盐水稀释，否则有可能腹水血性。超过 7 天的腹水再传代，动 物的周龄太大（ 6周）, 传代次数太多也很容易出现血性腹水。一般小鼠肿瘤模 型都控制在 30 多代以内（也有说 50 多代的）。出现血性以后可以调整一下：血 性腹水可以离心后加的NH4CL容液破红细胞，然后精确控制条件（接种量，传代 时间，动物周龄等） 传几代， 很多情况下再传一两代后会有无腹水血性的种鼠出 现，然后用这只种鼠的腹水继续

10、传代。腹水难抽有几种情况，要么接种天数不够，腹水不够多，一般要等动物肚子 很大了才去抽。要么就是压力的问题。 有的动物腹水很稠。 这时可撕开小鼠肚子， 拿掉针头，直接抽干净，最多的时候可抽到 5ml。3. 接种这个时候抽取的腹水需要量比较多， 有时需要处死种鼠后， 小心地用消毒眼 科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子（最好是哪种前面 有倒勾的 镊子，学名好像是唇型镊）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口， 然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。 然后进过一定的稀释后， 接种 到小鼠的腋下。关于稀释量，各个实验室的情况都不一样，最好摸索一下，开始 的时候可以适当的计数， 但

11、是要用台盼兰染色后计活细胞数 （计数的时候要注意， 有一些很细小的细胞是血细胞， 不要计数） 。如果接种细胞量偏大会造成肿瘤早 期就溃烂， 所以不要为了追求肿瘤生长速度而一味的提高接种细胞量。 接种部位 在小鼠腋下，但是不要深入到 腋窝里面，会给以后的操作带来麻烦。可以往尾 部或背部靠一些， 不要往腹部靠， 容易使肿瘤被垫料磨烂。 接种部位可以选择腋 下或者后肢 , 有的文章说是背部接种 ,但是背部血管不发达 , 营养不够 , 一般不建 议采用.接种时的进针处离接种处远一点，让针头在皮下多走一段，不容易污染。有 的人接种的时候喜欢针头向上用力，紧贴着表皮往 里走，然后注射的时候感觉 阻力较大，

12、打出来的皮丘又紧又圆，这样的接种，会使肿瘤与皮肤严重粘连，不 利于最后肿瘤的剥取。 也不要紧靠肌肉， 肿瘤会与肌肉严重粘连。 应该在两者之 间，接种的时候要精确控制接种在皮下，进针深度左右 , 针头沿皮肤水平进入 , 然后挑起表皮 , 注射。进针的感觉轻松自如，针头很自由，虽然打出来的肿瘤不 会很圆很漂亮，但是相对好剥取一些。防止接种的时候老鼠乱动，正确手法是用拇指和食指捏住老鼠的颈部皮肤， 无名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住， 捏颈部的时候手指尽量多捏一点皮肤， 然 后右手（你是左手抓动物的话） 拉住后肢，尽量往下拉， 让老鼠的身体伸展开来， 在用无名指固定， 中指可以放在老鼠的身体下面， 适

13、当的往上顶， 使老鼠的腋下 一代完全平展， 皮肤不用绷得太紧， 平展就可以了， 另外接种的时候进针点很靠 下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能动就 说明在皮下，否则可能 在皮内或者肌肉内。一般来说都是有鼓包的但是要是你 接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。主要靠针头稍微动一动来判断。4. 观测指标主要是按时称体重， 试验结束后剥取肿瘤称瘤重。 因为出瘤已经是接种后 的第 6 天左右了，第 10 天就结束时间，瘤体积的数据意义就不大。小鼠肿瘤很 难剥，只能耐心，没有太好的办法，剥多了以后，手上会掌握一些巧力，有一些 帮助，但是我们还是很头痛小鼠肿瘤试验结束。 肿瘤

14、组织周围经常会有一些血窦 的形成，弄破后会有血和黄色的液体流出， 正常的， 但是剥瘤子的时候不要把它 弄破，会严重影响瘤重。按照SFDA勺规定，平均瘤重小于1g,或者单个瘤重 小 于200mg认为肿瘤生长不良，试验作废。第二类是以lewis肺癌、B16为代表的，他们的宿主多为 C57。不产生腹水， 只能皮下生长。 多用插块法或者匀浆法传代和接种。 有一种做法也是接种后第二 天开始给药， 还有一种做法是接种三天后给药， 接种后两周结束试验， 剥取肿瘤 称重。1. 瘤种构建体外细胞株，培养后PBS悬浮至13X 106/site，接种至小鼠腋下，即可。2. 传代与接种体内瘤源用于传代接种，有两种手段

15、（均为无菌操作），套管针插块法对 瘤组织损伤小， 可能 100成瘤。 匀浆法对瘤组织损伤大， 成瘤可能小于 100。（1）插块法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于在PBS或% 无菌氯化钠注射液中洗涤干净， 然后剪开， 去处中心颜色变暗坏死部分， 以及外 表的包膜（如果比较明显的话），选外围发亮部分。清洗干净，然后换到干净的 PBS中，用剪刀剪成1mmft径左右的小块，最后用镊子将小块从针头处塞进1820 号的接种套管针（最好用的是胸膜活检针 20 号，但是现在已经买不到了，可以 用硬脊膜外穿刺针 18 号磨平针头后代替），在老鼠的皮肤上剪一小口，接种于 动物腋下或者其他部位。 塞

16、的组织块的量以接种针头的口径为准， 不能太紧也不 能太松，以孔径为标尺， 尽量保持差不多大小的接种量。 如出现出针挂组织的问 题，关键在于针头的磨制， 在针后部的小突起于小缺口吻合后， 实体针弯曲方向 应该与套管针磨制的斜面一致，接种时，实体针要推到底，也就是后 面的小突 起与小缺口契合， 然后针头“舔住”肌肉层转一圈再退针， 还有就是瘤块一定要 完全塞入针头内，外面不能有漏出来的。（2）匀浆法：种鼠处死后体表消毒，将肿瘤组织剥离下来后，置于PBS等体系中（以下均以PBS为例），用剪刀剪开，剔出中心的坏死部分，以及外表的包 膜（如果比较明显的话），清洗干净，然后换到干净的PBS中，用剪刀剪成1

17、mm直径左右的小块， 然后用玻璃匀浆器匀浆， 注意上下次数不可超过 5 次，匀浆时 可以适当的旋转， 200目筛网过滤，然后取滤液用台盼兰活细胞计数，根据计数 结果进行稀释， 最后将组织悬液用注射器接种。 最终的稀释量， 需要根据你瘤株 情况确定的接种量而定， 这个接种量经过一段时间的稳定后， 可以根据经验 （匀 浆液的浓度、粘度、肿瘤组织大小等情况）直接进行稀释，不需要计数，但是在 早期，还是建议进行计数后再稀释。 另外各种瘤株的情况不一样， 不光是接种量 不同，同样大小的瘤源匀浆后的活细胞数也会不同。比如NCI-H460匀浆后的活细胞数就比较多，而 A431 几乎没有活细胞。另外，如果一个瘤源不够，可以取 多个瘤源进行接种， 一般来说， 插块法， 一个瘤源接种 30 只动物是没有问题的， 匀浆法一般 2只也可以接种 30只 了，为保险起见可以多预备一只瘤源。 注意考 虑可能需要剔出不合格瘤源的情况。最好不用带血清的培养液代替 PBS因为血清是异种蛋白，虽然裸鼠 T细胞 缺陷，但是B细胞和NK细胞完整，含血清的物质会引起裸鼠的免疫反应，连带 着接种的瘤组织也会被影响， 降低成瘤率和生长速度。 从成瘤效果来说， 无血清 培养基 P BSsaline 。肿瘤模型体内传代的标准是，肿瘤体积大于 500mm以上就可以了，最好小 于 1000mm3接种的动物