荧光定量PCR实验技术干货

1、Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 荧光定量荧光定量PCR技术及数据处理分析技术及数据处理分析 项目部项目部 内容概要内容概要 荧光定量荧光定量PCR的原理的原理 荧光定量荧光定量PCR解析方法解析方法 荧光定量实验流程荧光定量实验流程 荧光定量荧光定量PCR仪仪 生工荧光定量产品选择指南生工荧光定量产品选择指南 荧光定量荧光定量PCR原理原理定义定义 实时定量实时定量PCR技术：技术： 利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩每一个循环扩 增产物量的变化增产物量的变化，对，对起始模板起始模板进行定量分析进行

2、定量分析 与常规与常规 PCR技术比较：技术比较： 对对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起无法对起 始模板准确定量始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测，无法对扩增反应实时检测 3 荧光定量荧光定量PCR原理原理标记方法标记方法 4 SYBR Green I TaqMan Probe分子信标分子信标 SYBR Green I 染料法染料法SYBR Green I 5 SYBR Green I是一种结合于所有是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有双螺旋小沟区域的具有 绿色激发波长的染料。绿色激发波长的染料。 SYBR Green I

3、 染料法染料法作用机理作用机理 6 SYBR Green I 染料法染料法融解曲线融解曲线 7 将温度与荧光强度的变化求导将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT) 原始图谱原始图谱对数图谱对数图谱 SYBR Green I 染料法染料法融解曲线融解曲线 8 融解曲线分析，单一融解曲线分析，单一 峰无非特异性荧光：峰无非特异性荧光： 定量准确定量准确 融解曲线分析，出现融解曲线分析，出现 杂峰其他产物出现非杂峰其他产物出现非 特异性荧光：特异性荧光： 定量不准确定量不准确 Taqman 探针法探针法原理原理 9 5端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) ，如，如FAM、V

4、IC等等 3端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ，MGB 为不发光的荧光基团为不发光的荧光基团 探针完整，探针完整，R发射的荧光能量被发射的荧光能量被Q基团吸收基团吸收 ，无荧光，无荧光， R与与Q分开，发荧光分开，发荧光 Taq酶有酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针，外切核酸酶活性，可水解探针，R与与Q分开，发荧光。分开，发荧光。 Taqman 探针法探针法工作机理工作机理 Taqman 探针法探针法PCRPCR体系的建立体系的建立 引物、探针的设计：引物、探针的设计： 探针探针Tm为为68-70, 30 bp, 5不能有不能有G, G可能会淬灭荧光素可能

5、会淬灭荧光素 引物尽量靠近探针引物尽量靠近探针, 扩增片段扩增片段400 bp, 引物引物Tm为为59-60 反应参数的确定：反应参数的确定： 一般为：一般为：94 ，10-20S 60，30-60S （Taq酶酶53外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度最高），也可通过温度梯度优化退火温度 优化引物和探针浓度：获得最小优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号值，最大信号/背景比值背景比值 引物浓度：引物浓度：100-900nM 探针浓度：探针浓度：50-300nM 其他与常规其他与常规PCR相同相同 实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信

6、标 12 标记荧光的发夹探针标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成茎由互补配对序列组成 环环 茎茎 荧光素荧光素 淬灭剂淬灭剂 实时荧光定量实时荧光定量PCR分类分类分子信标分子信标 13 FRET 几种荧光定量几种荧光定量PCR方法的应用比较方法的应用比较 荧光定量荧光定量PCR原理原理常用名词概念常用名词概念 +扩增曲线扩增曲线 +荧光阈值荧光阈值 +Ct值值 荧光定量荧光定量PCR原理原理扩增曲线扩增曲线 16 Cycle（循环数）（循环数） Rn（荧光强度）（荧光强度） Baseline Lgliner phase 平台期平台期 荧光基团荧光基团 荧

7、光检测元件荧光检测元件 荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光阈值荧光阈值 17 Cycle（循环数）（循环数） Rn（荧光强度）（荧光强度） Baseline Lgliner phase 平台期平台期 前前15个循环信号作为荧光本底个循环信号作为荧光本底 信号（信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是荧光阈值的缺省设置是315个个 循环的荧光信号的标准偏差的循环的荧光信号的标准偏差的 10倍倍 手动设置手动设置:大于荧光背景值和阴大于荧光背景值和阴 性对照的荧光最高值；进入指性对照的荧光最高值；进入指 数期的最初阶段数期的最初阶段 真正的信号真正的信号:荧光信号超过阈值荧光信号超过阈值 T

8、hreshold 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值值 18 Cycle（循环数）（循环数） Rn（荧光强度）（荧光强度） Ct值的定义：值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物 的荧光信号达到设定的阈值的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数时所经过的扩增循环次数 Ct value 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值的重现性值的重现性 19 横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数 纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量 Ct值的特点：值的特点： 相同模板进行相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性值极具重现性

9、荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理 20 理想的理想的PCR反应反应XnX0 2n * Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量：起始模板数量 n：扩增循环数：扩增循环数 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理 21 非理想的非理想的PCR反应反应 XnX0 （1En）n * Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量：起始模板数量 n：扩增循环数：扩增循环数 En：扩增效率：扩增效率 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值定量的数学原理值定量的数学原理

10、22 在扩增产物达到荧光阈值时在扩增产物达到荧光阈值时 XCtX0 * （1En）CtM （1） 整理方程式（整理方程式（2）：）： 方程式（方程式（1）两边同取对数得：）两边同取对数得： XCt：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后， 它是一个常数，定为它是一个常数，定为M Log2MLog2X0 *（1En）Ct （2） Log2X0 = Log 2M - Ct Log2（1En） 荧光定量荧光定量PCR原理原理CtCt值与起始模板量的关系值与起始模板量的关系 23 Cycle number Ck 104 Ck 102 S

11、ample Lg of DNA concentration 模板模板DNA量越多，荧光达量越多，荧光达 到阈值的循环数越少，即到阈值的循环数越少，即 Ct值越小。值越小。 Log模板起始浓度与模板起始浓度与Ct值值 呈线性关系。呈线性关系。 荧光定量荧光定量PCR原理原理荧光定量反应性的确认荧光定量反应性的确认 24 线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认 相关系数（相关系数（R2）：大于）：大于0.98 标准曲线斜率：标准曲线斜率：-3 -3.5 PCR扩增效率（扩增效率（E）：）：0.9-1.2 检测灵敏度确认检测灵敏度确认 35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果

12、如果采用如果采用SYBR检测方法，检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增 No template control确认确认 35 Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体产生 荧光定量荧光定量PCR技术的主要应用技术的主要应用 定性分析研究定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等）分析等 绝对定量研究绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量 ，GMO定量检测等定量检测等 相对定量研究相对定量研究：mRNA表达量分析，表达量分析，siRNA效果确认，差效果确认，差 异显示结果验证等异显示

13、结果验证等 荧光定量荧光定量PCR的解析方法的解析方法 1绝对定量解析方法绝对定量解析方法 1相对定量解析方法相对定量解析方法 绝对定量的定义绝对定量的定义 27 Sample 2 5 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的 标准品标准品 可作出标准曲线可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量分析几要素绝对定量分析几要素 28 一个一个目的基因目的基因 即需要确定其量值的核酸序列。即需要确

14、定其量值的核酸序列。 一组一组标准样本标准样本 用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒 、PCR产物、基因组产物、基因组DNA等。等。 重复反应孔重复反应孔 建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统 计显著性。计显著性。 标记方法的选择标记方法的选择 SYBR Green I 法或法或Taqman 探针法均可。探针法均可。 实验结果显示实验结果显示 扩增曲线；标准曲线；融解曲线扩增曲线；标准曲线；融解曲线(探针法不需要探针法不需要)。 绝对定量质粒标准品的制备绝对定量质粒标准品的制备 29 PCR 目

15、的基因克隆目的基因克隆 目的基因目的基因 目的基因目的基因 质粒质粒 基因组基因组DNA 质粒提取，质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 质粒标准品稀释方法质粒标准品稀释方法 30 倍比梯度稀释方法：倍比梯度稀释方法： 1v原液原液(标准品标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品稀释缓冲液，得标准品v 绝对定量实验例绝对定量实

16、验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量 31 方法：方法：检测毕赤酵母的检测毕赤酵母的A基因基因 标准品：标准品：质粒标准品浓度为质粒标准品浓度为5个浓度；个浓度；3个重复；设阴性空白对照个重复；设阴性空白对照 实验步骤：实验步骤： 提取提取A DNA； 设计特异引物；设计特异引物； 设计设计TaqMan探针并标记探针；探针并标记探针； 荧光定量扩增；荧光定量扩增； 结果分析：获取毕赤酵母的结果分析：获取毕赤酵母的A的精确的精确copy数。数。 绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量 绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因

17、的绝对定量基因的绝对定量 33 扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E =10-1/斜率 斜率 - -1 =10-1/-3.481 - -1 =1.983-1 =0.938 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线 y = -3.481x + 40.123 R2 = 0.9996 绝对定量实验例绝对定量实验例毕赤酵母毕赤酵母A A基因的绝对定量基因的绝对定量 34 未知样品拷贝数的计算未知样品拷贝数的计算 将将Ct值带入线性方程：值带入线性方程： 18.45= -3.481 X +40.123 QuantityUnknown=10 6.226 =

18、1682674 copies X= 18.45-40.123 -3.481 =6.226 相对定量的必要性相对定量的必要性 35 目的基因扩增效率相同目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同提取效率相同 细胞起始数相同细胞起始数相同 相对定量分析方法相对定量分析方法 36 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ 关注点：关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ 相对定量分析几要素相对定量分析几要素 37 一个一个参照样本参照样本 一个或一个以上的一个或一个以上的未知样本未知样本 一个一个目的基因目

19、的基因 管家基因管家基因用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔重复反应孔建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性 标记方法的选择标记方法的选择SYBR Green法或探针法均可法或探针法均可 实验结果显示实验结果显示扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线 （探针法不需要）（探针法不需要） 一组一组标准样本标准样本（有些分析方法不需要）（有些分析方法不需要） 相对定量分析相对定量分析管家基因筛选管家基因筛选 38 管家

20、基因管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因，维持细胞基本代谢活动所必须的基因， 如：如：GAPDH、Actin、18S rRNA等等 筛选方法筛选方法 根据文献提供根据文献提供 通过具体实验筛选通过具体实验筛选 P P P P P P O O 相对定量分析相对定量分析两种常用的分析方法两种常用的分析方法 39 双标准曲线法双标准曲线法 2 - Ct法 法 相对定量分析相对定量分析双标曲线法双标曲线法 40 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量 ，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。，然后根据计算公式求

21、得相对值即为相对表达量。 公式：公式： 相对值相对值= 校正值校正值= 目的基因定量结果目的基因定量结果 管家基因定量结果管家基因定量结果 待测样品的校正值待测样品的校正值 对照样品的校正值对照样品的校正值 相对定量分析相对定量分析双标曲线法双标曲线法 41 优点：分析简单，实验优化相对简单优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 实验数据实验数据 相对定量分析相对定量分析2 2 CtCt法

22、法 42 假设目标序列与内参序列扩增效率相同：假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或或 最后用任一待测样本最后用任一待测样本 q 的的 XN 除以对照样本（除以对照样本（calibrator，cb）的）的 XN 得到：得到： 对于一个少于对于一个少于 150bp 的扩增片断而言，如果的扩增片断而言，如果 Mg 2+ 浓度、引物都进行了适当的优浓度、引物都进行了适当的优 化，扩增效率接近于化，扩增效率接近于 1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子 而言就是：而言就是： XT 是目标基因达到设定的阈值时的分子数是目标基因达到设

23、定的阈值时的分子数 RT是内参基因达到设定的阈值时的分子数是内参基因达到设定的阈值时的分子数 相对定量分析相对定量分析2 2 CtCt法 法 43 公式：公式： F = 2 优点：优点：无需作标准曲线无需作标准曲线 缺点：缺点： 假定扩增效率为假定扩增效率为 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致；假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。实验条件优化较为复杂。 应用：应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一 待测组目的基因待测组目的基因 平均平均Ct值值 待测组内参基因待测组

24、内参基因 平均平均Ct值值 对照组目的基因对照组目的基因 平均平均Ct值值 对照组内参基因对照组内参基因 平均平均Ct值值 相对定量分析相对定量分析2 2 CtCt法 法 44 实验数据：实验数据： 2 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近 法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100% Ct（处理前）（处理前）15132 Ct（处理后）（处理后）1820=2 Ct=Ct（处理后）（处理后）Ct（处理前）（处理前）224 比率比率（处理后 （处理后/处理前）处理前） 2 Ct 2（ （4） 16 所以所以Jun基因在处理后表达水平是处理前的基因在处理后表达水平是处理前的16倍倍

25、修正方法：修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不 等于等于2，那么，那么2 Ct可以修正为： 可以修正为：E Ct，例如扩增效率为 ，例如扩增效率为1.95，那么计算公式，那么计算公式 可修正为可修正为1.95 Ct 荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项 45 样品制备样品制备 定量体系配备定量体系配备 引物设计引物设计 反应条件优化反应条件优化 浓度确定浓度确定 技能要求技能要求 环境要求环境要求 误差控制误差控制 数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍 RT 上机上

26、机 反应体系优化反应体系优化 试剂选择试剂选择 分析方法分析方法 荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项 46 样品制备样品制备环境要求环境要求 定量体系配备定量体系配备 数据分析数据分析 RT 上机上机 浓度确定浓度确定 无无RNase环境环境 使用无使用无RNase耗材耗材 专用专用RNase-free工具工具 分光光度计检测分光光度计检测 电泳检测电泳检测 荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项 47 样品制备样品制备 试剂选择试剂选择 定量体系配备定量体系配备 数据分析数据分析 RT 上机上机 反应体系优化反应体系优化 AMV M-MLV 下游反应数确定反转录体积下游反应数确定反转录体积 引物的选择引物的选择 荧光定量荧光定量(SYBR Green)实验流程及注意事项实验流程及注意事项 48 样品制备样品制备 误差控制误差控制定量体系配备定量体系配备 数据分析数据分析 RT 上机上机 浓度确定浓度确定 引物设计引物设计