荧光分析法实验版

1、荧光分析法 第一节 概 述 当紫外线照射到某些物质的时候，这 些物质会发射出各种颜色和不同强度的可 见光，而当紫外线停止照射时，所发射的 光线也随之很快地消失，这种光线被称为 荧光(fluorescence)。 由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光 的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进的波长和发射光的波长也不同，利用这个特性可以进 行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发行物质的定性鉴别。如果该物质的浓度不同，它所发 射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进射的荧光强度就不同，测量物质的荧光强度可对其进 行定量测定。行定量测定。

2、 荧光分析法（荧光分析法（fluorescence analysis）就是利）就是利 用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分 析的方法。析的方法。 荧光分析法具有灵敏度高，比分光光度法高 103104倍。线性范围宽，方法简便快速且选 择性较好等多优点。 近20年来，各式各样新型荧光分析仪不断问 世，荧光分析法发展迅速，应用面日益拓宽， 尤其是在生物试样的分析及生命科学研究方面 （如DNA序列分析等）展现出广阔的前景。 一、荧光的产生一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能级和转动能级。物质分子的能级包括一系列电子能级、振动能

3、级和转动能级。 分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发 态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快， 大约大约1010-15 -15 s s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定， ），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定， 可以通过以下几种途径释放能量返回基态。可以通过以下几种途径释放能量返回基态。 1. 1. 振动驰豫振动驰豫 2. 2. 内转换内转换 3. 3. 荧光荧光 4. 4. 系间窜跃系间窜跃 5. 5. 磷光磷光 （一）荧光的检测 光源发出的紫外可见光

4、通过激 发单色器分出不同波长的激发 光，照射到样品溶液上，激发 样品产生荧光。样品发出的荧 光为宽带光谱，需通过发射单 色器分光后再进入检测器，检 测不同发射波长下的荧光强度 F。由于激发光不可能完全被 吸收，可透过溶液，为了防止 透射光对荧光测定的干扰，常 在与激发光垂直的方向检测荧 光（因荧光是向各个方向发射 的）。 （二）激发光谱与荧光光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱， 即激发光谱(excitation spectrum)和荧光发射光 谱(fluorescence emission spectrum)。 1. 激发光谱 保持荧光发射波长不变（即固定发射单色 器），依次改变激发

5、光波长（即调节激发单色 器），测定不同波长的激发光激发下得到的荧 光强度F（即激发光波长扫描）。然后以激发 光波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图， 就可得到该荧光物质的激发光谱。 激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长 就是最大激发波长，是激发荧光最灵敏的波长。 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似，所不同 的是纵坐标。 2. 荧光光谱 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波 长不变（即固定激发单色器），依次改变荧光 发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光 强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为 纵坐标作图，得到荧光发射光谱。荧光发射光 谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大发 射波长。 三

6、、影响荧光产生及荧光强度的因素影响荧光产生及荧光强度的因素 （一）物质产生荧光的必要条件（一）物质产生荧光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低，与它的分子结构 及所处的环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个 条件： 1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有*跃迁）； 2. 物质具有较高的荧光效率（fluorescence efficiency）。荧光效 率也称荧光量子产率，用f 表示。 可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可 增加荧光量子产率。通常，kF 由分子结构决定（内因），而其它 参数则由化学环境和结构共同决定。 PECISCICVRF F f kkk

7、kkk k 吸收的光量子数 发射的荧光量子数 （二）影响荧光及其强度的因素。（二）影响荧光及其强度的因素。 跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光跃迁类型：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光 效率才能产生荧光。具有效率才能产生荧光。具有 * * 跃迁的分子才有强吸收。跃迁的分子才有强吸收。 * * 跃迁的跃迁的 大。大。 共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环，共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环， 具有共轭的具有共轭的 * 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈 大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，

8、如苯、大，且最大激发和发射波长都向长波长方向移动，如苯、 萘、蒽三种物质。萘、蒽三种物质。 刚性平面结构：刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的当荧光分子共轭程度相同时，分子的 刚性和共平面性越大，荧光效率越大。刚性和共平面性越大，荧光效率越大。 C O O O COO 荧光物质（荧光素） C O O COO 菲荧光物质（酚酞） 取代基团取代基团 温度温度 溶剂溶剂 pH值值 荧光熄灭荧光熄灭 由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的由于荧光物质分子间或与其它物质相互作用，引起荧光强度显著下降的 现象叫做荧光熄灭（现象叫做荧光熄灭（quenchingquenchi

9、ng）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭）或猝灭。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭 剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化剂，如卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化 合物等。合物等。 造成荧光熄灭的原因有多种：造成荧光熄灭的原因有多种： （1 1）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭；）激发态荧光分子和熄灭剂分子碰撞，将能量转移到熄灭剂而使荧光熄灭； （2 2）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物；）荧光分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配合物； （3 3）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越

10、而转变为三重态；）荧光物质分子中引入重原子后，易发生系间窜越而转变为三重态； （4）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自）当荧光物质浓度较大时，激发态分子和基态分子发生碰撞，产生荧光自 熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重；熄灭现象。溶液浓度越高，自熄灭现象越严重； （5）溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄）溶液中溶解的氧分子能引起几乎所有的荧光物质产生不同程度的荧光熄 灭。灭。 荧光熄灭是荧光分析的不利因素。但是如果一个荧 光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的减小和熄灭剂 的浓度呈线性关系，则可以利用这一性质建立熄灭剂的 荧光分析法，

11、称为荧光熄灭法。荧光熄灭法比直接荧光 法更灵敏、更有选择性。例如铝-桑色素配合物的荧光强 度因微量氟离子的存在而引起荧光熄灭，利用这种性质 可测定样品中微量氟离子的含量，这时溶液的荧光强度 和氟离子浓度成反比。 第二节第二节 定性定量分析定性定量分析 一、荧光强度与溶液浓度的关系一、荧光强度与溶液浓度的关系 分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光分光光度法是测定物质对光的吸收程度；荧光 分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质分析法是测定物质吸收了一定频率的光之后，物质 本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入本身所发射的荧光强度。当溶液中的荧光物质被入 射光激发后，可以在各个方向观

12、察到荧光，由于激射光激发后，可以在各个方向观察到荧光，由于激 发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧发光一部分可透过溶液，所以在透射光方向观察荧 光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察光是不适宜的，一般是在与透射光垂直的方向观察 荧光。荧光。 测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一测定荧光强度时，要选择两个不同的波长：一 个是物质吸收的光，即激发光的波长；另一个是被个是物质吸收的光，即激发光的波长；另一个是被 激发物质发射的光，即荧光的波长。激发物质发射的光，即荧光的波长。 在稀溶液中，荧光强度在稀溶液中，荧光强度I If f与入射光的强度与入射光的强度IoIo、荧光量子效率、荧

13、光量子效率f f 以及荧以及荧 光物质的浓度光物质的浓度c c等有关，可表示为等有关，可表示为I If f=K=Kf fIobcIobc。 （式中（式中K K为比例常数，为比例常数， 与仪器性能有关，与仪器性能有关，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，b b为液层厚度）。由此可见，当仪为液层厚度）。由此可见，当仪 器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光 的强度时，荧光强度的强度时，荧光强度 I If f与荧光物质的浓度与荧光物质的浓度c c成正比。（对于某种荧光物成正比。（对于某种荧光物 质的稀溶液，在一定的频率

14、及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够质的稀溶液，在一定的频率及强度的激发光照射下，当溶液的浓度足够 小使得对激发光的吸光度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质小使得对激发光的吸光度很低时，所测溶液的荧光强度才与该荧光物质 的浓度成正比。）的浓度成正比。） 当当abc0.05（即溶液很稀）时，（即溶液很稀）时， ! 2 )3 . 2( 3 . 2 2 0 abc abcIKF abcIKF 0 3 . 2 对于一定的荧光物质，当测定条件固定时，对于一定的荧光物质，当测定条件固定时， cKF 即对一定的荧光物质的稀溶液（即对一定的荧光物质的稀溶液（abc0.05），）， 在一定的温度下，当激

15、发光的波长、强度和液在一定的温度下，当激发光的波长、强度和液 层厚度都固定后，其荧光强度与该溶液的浓度层厚度都固定后，其荧光强度与该溶液的浓度 成正比。这是荧光分析定量的基础。成正比。这是荧光分析定量的基础。 第三节 仪器 一、仪器的构造及原理 仪器类型很多，基本结构相似，一般包括五部分：激仪器类型很多，基本结构相似，一般包括五部分：激 发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。 1. 光源 能发射紫 外到可见区波长 的光、强度大、 稳定。常用的有 溴钨灯、高压汞 灯、氙灯。 二、仪器类型二、仪器类型 1. 1. 光电荧光计光电荧光计 用滤光片

16、作单色器（激发滤用滤光片作单色器（激发滤 光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光光片和荧光滤光片），溴钨灯或高压汞灯作光 源，光电管为检测器。源，光电管为检测器。 2. 2. 荧光分光光度计荧光分光光度计 用氙灯作光源、光栅作用氙灯作光源、光栅作 单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激单色器，光电倍增管为检测器。可连续扫描激 发光谱和荧光光谱。发光谱和荧光光谱。 WGY-10型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质 的激光光谱和荧光光谱。采用计算机完成仪器的系统控制和数的激光光谱和荧光光谱。采用计算机完成仪器的系统控制和数 据采集。其工作原理如下

17、：据采集。其工作原理如下： 由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照由光源发出的光，通过激发单色器后变成单色光，而后照 在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收在荧光池中的被测样品上，由此激发出的荧光被发射单色器收 集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相集后。经单色器分散成单色光而照射在光电倍增管上转换成相 应的电信号，经放大器放大反馈入应的电信号，经放大器放大反馈入A/D转换单元，将模拟电信转换单元，将模拟电信 号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被号转换成相应的数字量。并通过显示器或打印机显示记录下被 测样品的图谱。这就是荧光光度计的

18、基本工作原理。测样品的图谱。这就是荧光光度计的基本工作原理。 WGY-10荧光分光光度计仪器的使用荧光分光光度计仪器的使用 点击电脑桌面“WGY-10荧光分光光度计”的图标进入 “WGY-10”友好界面。（此时分别进行激发光珊检零，激 发光珊检索为起始波长，激发光珊检索为起始波长等一系 列检索）约3分钟 点击菜单栏“发射”图标 先固定发射波长为400 nm，出现“正在检索发射波长，请稍 等”如荧光强度大于50，负高压选95，荧光强度小于 50，则选100 工作模式：激发扫描 起始波长：250 终止波长：350 负高压为：100（95） 点击“单程”输入通道号，出现激发光谱（通道1）然后点击 “

19、读取数据”进入“自动寻峰”保存txt文件 清除当前 （建立）在曲线上找最大激发波长297 nm 再选定激发波长297nm（正在检索激发波长） 工作模式：发射扫描 起始波长：350 终止波长：500 负高压为：100（90） 点击“单程”输入通道号，出现发射光谱（通道2）然后点击 “读取数据”进入“自动寻峰”保存txt文件 清除当前 （建立）在曲线上找最大激发波长397 nm点击文件，选择 保存。 再选定发射波长397nm，起始波长改为250nm点击“单程”选 择通道2。则出现水杨酸溶液的光谱图（含激发光谱和发射 光谱）点击保存文本文件，在点确定，输入文件名，“保 存” 点击“工作”再点“定量测

20、量”出现“定量测量-标准曲线”, 点击“编辑”，修改浓度单位ug/mL，确定点击“添加” 依次输入浓度0、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0再分别点击“本 底测量”、“单项测量”最后点击“计算标准曲线”最后 “样品测量”。 后期作图 1.打开origin软件x.txt找到已保存的文件（两个通 道）AddOK 点击 Add AddOK。 出现光谱图 2.双击X AXTS TITLE，出现对话框，改为x/nm,双击y Ax改为 y/F.点击 图标，移动鼠标到峰点，再点T图标，再点左键 ，输入数值297nm 重复再输入另一峰值 重复输入excitation emission 即成 3.再点击Fi

21、le(电脑左上方) （save project）点击，输入文件 名，点保存。 4最后点击Edit(在File后)，点击copy page,即可复制在 word文档。 这件完整的图形即可在用U盘拷贝了。 第五节 荧光分析法的应用 （一）（一） 有机物的荧光分析有机物的荧光分析 （二）（二） 无机元素的荧光分析无机元素的荧光分析 （三）在生命科学中的应用三）在生命科学中的应用 荧光分析测定邻、间荧光分析测定邻、间-羟基苯甲酸混合物中羟基苯甲酸混合物中 的二组分析含量的二组分析含量 一，目标要求一，目标要求 1.学习荧光分析法的基本理论和操作学习荧光分析法的基本理论和操作; 2.用荧光分析法进行多组

22、分含量的测定。用荧光分析法进行多组分含量的测定。 二，原理二，原理 某些具有某些具有-电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物 质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。 建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为荧光分析法，而常把被测物称为荧 光物质。在稀溶液中，荧光强度光物质。在稀溶液中，荧光强度It与入射光的强度与入射光的强度Io、荧光量子效率、荧光

23、量子效率f 以及荧光以及荧光 物质的浓度物质的浓度c等有关，可表示为等有关，可表示为If=KfIobc。 式中式中K为比例常数，与仪器性能有为比例常数，与仪器性能有 关，关，为摩尔吸光系数，为摩尔吸光系数，b为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大为液层厚度。由此可见，当仪器的参数固定后，以最大 激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度 If与荧光物质与荧光物质 的浓度的浓度c成正比。成正比。 在中性水溶液中，邻在中性水溶液中，邻-羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（羟基苯甲酸（水杨酸）生成分子内氢键（ ）增加

24、分子）增加分子 的刚性而有较强荧光，而间的刚性而有较强荧光，而间-羟基苯甲酸则无荧光。在羟基苯甲酸则无荧光。在PH的碱性溶液中，二者在的碱性溶液中，二者在 310nm附近的紫外光照射下则均会发生荧光，且邻附近的紫外光照射下则均会发生荧光，且邻-羟基苯甲酸的荧光强度与其在羟基苯甲酸的荧光强度与其在 PH5.5时相同。因此，在时相同。因此，在PH5.5时可测定水杨酸的含量，间时可测定水杨酸的含量，间-羟基苯甲酸不干扰。羟基苯甲酸不干扰。 另取同量试样溶液调另取同量试样溶液调PH到到12，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求，从测得的荧光强度中扣除水杨酸产生的荧光即可求 出间出间-羟基苯甲酸

25、的含量。在羟基苯甲酸的含量。在012ug/ml范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关范围内荧光强度与二组分浓度均呈线性关 系。对系。对-羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。羟基苯甲酸在此条件下无荧光，因而不干扰测定。 三，仪器及试剂三，仪器及试剂WGY-10型荧光分光光度计（天津） 容量瓶（25 ml） 分度吸量管5 ml 2 ml 邻-羟基苯甲酸标准溶液：称取水杨酸0.1500g溶解并定容于1L 容量瓶中。 间-羟基苯甲酸标准溶液：称取间羟基苯甲酸0.1500g溶解并 定容于1L容量瓶中。 醋酸-醋酸钠缓冲溶液：称取47g NaAc和6g 醋酸配成1LPH5.5 的缓冲溶液。 NaOH

26、溶液：0.1mol/L 未知液 四，实验内容四，实验内容 （1）、配制标准系列和未知溶液）、配制标准系列和未知溶液： 1、分别移取水杨酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量 瓶中，各加入2.5ml PH5.5的醋酸盐缓冲溶液，用去离子水稀释至刻度，摇 匀。 2、取0.6ml未知液两份于25ml 容量瓶中，各加入2.5ml PH5.5的乙酸缓冲 溶液，分别用去离子水稀释至刻度，摇匀。 3.分别移取间羟基苯甲酸羟基苯甲酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液， ，用去离子水稀释至刻度，摇匀。 4.取0.6ml未知液两份于25ml 容量瓶中，各加入3.0ml0.1mol/L溶液，分别 用去离子水稀释至刻度，摇匀。 （2）、激发光谱和发射光谱的测绘）、激发光谱和发射光谱的测绘用（1）中的第四份溶液测绘各自的激 发光谱和发射光谱。先固定发射波长为400nm在250350nm进行激发波长 扫描