Molecularfluorescencespectroscopy分子荧光光谱法

1、Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 分子荧光光谱法实验分子荧光光谱法实验 Molecular fluorescence spectroscopy 分子荧光光谱法分子荧光光谱法 测定左旋氧氟沙星片含量测定左旋氧氟沙星片含量 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 光致发光（光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光荧光和磷光是分子吸光 成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 特点：特点： 灵敏度高。检测限比吸

2、收光谱法低灵敏度高。检测限比吸收光谱法低13个数量级；个数量级； 线性范围宽；线性范围宽； 选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不 一定发射荧光或磷光；一定发射荧光或磷光； 应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光 谱法。谱法。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 一。目的和要求 学习荧光分光光度计的使用方法 掌握荧光

3、分光光度法测定样品含量的基 本方法 荧光分光光度计 上海仪电CRT型 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 二、荧光光谱法基本原理二、荧光光谱法基本原理 分子的激发与失活分子的激发与失活 1. 1. 分子的多重态分子的多重态 单重态单重态 一个所有电子自旋都配对一个所有电子自旋都配对 的分子的电子状态。大多数有机的分子的电子状态。大多数有机 物分子的基态是单重态。当基态物分子的基态是单重态。当基态 一对电子中的一个被激发到较高一对电子中的一个被激发到较高 能级，其自旋方向不会立刻改变，能级，其自旋方向不会立刻改变， 分子仍处于单重态。分子仍处于单重

4、态。 三重态三重态 有两个电子的自旋不配对有两个电子的自旋不配对 而平行的状态。激发三重态能量而平行的状态。激发三重态能量 较激发单重态低。较激发单重态低。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 2. 2. 激发态分子的失活激发态分子的失活: : 激发态分子不稳定，它要以辐射激发态分子不稳定，它要以辐射 或无辐射跃迁的方式回到基态。或无辐射跃迁的方式回到基态。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 无辐射跃迁无辐射跃迁 振动弛豫：振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级激发态分子由同一电子能级

5、中的较高振动能级 转至较低振动能级的过程，其效率较高。转至较低振动能级的过程，其效率较高。 内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回 到低能级的分子内过程。到低能级的分子内过程。 系间窜越：系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多 重态发生变化的过程。重态发生变化的过程。 外转换：外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转 换而使荧光换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的 减弱或消

6、失，称为荧光熄灭（或猝灭）减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 辐射跃迁辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大， 速率常数速率常数kf为为106109s-1。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 辐射能量传递过程辐射能

7、量传递过程 荧光发射：荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态 （ 多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光； 10- 710 -9 s 。 由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波 长长； 2 2 1 ； Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 二、激发光谱与荧光(磷光)光谱 1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧 光强度最大； 2.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或

8、磷光光谱) 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光 (或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 200260320380440500560620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光

9、谱的 波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量 (如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一 激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波 长一定的荧光(如 2 )。 c. 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱 形状一样）成镜像对称关系。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布 与第一激发态上的各振动能级 分布类似； 基态上的 零振动能级与 第一激发态的 二振动能级之

10、间的跃迁几率 最大，相反跃 迁也然。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构； （2）具有一定的荧光量子产率。 荧光量子产率（）： 吸收的光量子数 发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射； Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 2.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光 （1）跃迁类型：* 的荧光效率高，系间跨越过程的速率 常

11、数小，有利于荧光的产生； （2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 （3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作 用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光 素有很强的荧光，酚酞却没有。 （4）取代基效应：芳环 上有供电基，使荧光增 强。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 3.3.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。 内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾

12、； Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 4 4、溶液荧光的猝灭、溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭； 氧的熄灭作用等。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 四、仪器结构流程四、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。 特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图： 单色器单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器；

13、光源光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器检测器：光电倍增管。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 仪器框图仪器框图 该型仪器可进 行荧光、磷光 和发光分析； Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨 率； 如图。 合适的合适的可减少光谱重叠可减少光谱重叠； 酪氨酸和色

14、氨酸的荧光激发光谱相 似 ， 发 射 光 谱 严 重 重 叠 ， 但 60nm时，只显示色 氨酸的特征光谱，实现分别测定。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 五、荧光分析方法与应用五、荧光分析方法与应用 1. 1. 特点特点 （1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高24个数量级； 检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎

15、宁硫酸氢盐的硫酸溶液。 （2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱； （3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 2 2、激发光谱和荧光光谱、激发光谱和荧光光谱 任何荧光化合物都具有两种特征任何荧光化合物都具有两种特征 光谱：光谱： 荧光激发光谱（吸收光谱）荧光激发光谱（吸收光谱） 固定某一发射波长，测定该波固定某一发射波长，测定该波 长下的荧光发射强度随激发波长长下的荧光发射强度随激发波长 变化所得的光谱。变化所得的光谱。 荧光发射光谱（荧光光谱）荧光发射光谱（荧光光谱

16、） 固定某一激发波长，测定荧光固定某一激发波长，测定荧光 发射强度随发射波长变化得到的发射强度随发射波长变化得到的 光谱。光谱。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 3 3、荧光与结构的关系、荧光与结构的关系 （1 1）电子跃迁类型）电子跃迁类型 发射发射 *跃迁比跃迁比*n跃迁更常见跃迁更常见 （2 2）共轭效应）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多 数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程数未取代芳烃在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程 度增加，荧光峰红移，度增加，荧光峰红移，。简单杂环化

17、合物不发荧光，。简单杂环化合物不发荧光， 但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。 （3 3）平面刚性结构效应）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光，有刚性结构的分子容易发荧光， 刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。刚性和共平面性的增加有利于荧光发射。 CH2 联苯联苯 =0.2 芴芴 =1 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 化合物化合物 相对荧光强度相对荧光强度 苯苯 10 10 C6H5COOH C6H5NO2 3 0 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN 17

18、 18 20 20 20 C6H5Cl C6H5Br C6H5I 7 5 0 (4)(4)取代基的影响取代基的影响 芳环上有羧基、羰基或芳环上有羧基、羰基或 亚硝基等吸电子基团取亚硝基等吸电子基团取 代时，荧光减弱；代时，荧光减弱； 给电子取代基如给电子取代基如-OH-OH、- - NHNH2 2、-CN-CN、-OCH-OCH3 3等会使等会使 荧光强度增加。荧光强度增加。 重原子效应重原子效应 含有重原含有重原 子的分子中，系间窜跃子的分子中，系间窜跃 的几率大的几率大, ,使荧光减弱，使荧光减弱， 磷光增强。磷光增强。 Molecularfluorescencespectroscop y

19、分子荧光光谱法 4、定量依据与方法 (1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于吸收的光量正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ： If = Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后： If = 2.3 I0 l c = Kc Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 （2 2）定量方法）定量方法 标准曲线法：标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度

20、，绘制标准曲 线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线 上求出浓度； 比较法：比较法： 在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较； Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 5.荧光分析法的应用 (1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 (2)(2)生物与有机化合物的分析生

21、物与有机化合物的分析 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 名名 称称 结结 构构 式式 应应 用用 9-蒽基重氮甲烷蒽基重氮甲烷 某些羧酸某些羧酸 丹磺酰氯丹磺酰氯 伯胺、仲胺、酚或伯胺、仲胺、酚或 氨基酸氨基酸 CH2N2 N(CH3)2 SO2Cl 荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能 发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生 荧光。荧光。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 三。实验

22、方法 1.氧氟沙星荧光光谱绘制 取氧氟沙星对照品约0.100克，精密称定，置 于100ml量瓶中，用0.01mol/L HCl溶解后加水 至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液 0.4ml置于50ml量瓶中，加0.5mol/L HAc溶液 至刻度，摇匀，在荧光光度计上扫描氧氟沙星 的激发光谱和发射光谱。激发波长367nm，发 射波长505nm Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 2.标准曲线制作 精密量取储备液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml 分别置于 50ml 量瓶中，加0.5mol/L HAc 溶液至刻度，摇匀。其浓 度相当于10

23、,20,30,40,50 mg/L. 在Ex=367nm,Em=505nm处测定荧光强度，并建立 标准曲线。 Molecularfluorescencespectroscop y分子荧光光谱法 3.氧氟沙星片含量测定 取左旋氧氟沙星片一片，精密称定后置于100ml 量瓶中，加0.05mol/L HCl溶液10ml充分振摇溶 解后，加水稀释至刻度，摇匀。静置后干过滤。 精密量取滤液3.00ml置于100ml量瓶中，用 0.5mol/L HAc定容至刻度，摇匀。在 Ex=367,Em=505nm处测定荧光强度，根据标准 曲线计算氧氟沙星片的含量 氧氟沙星片含量 = (Cx3.30/ms) x 100% Molecu