质粒DNA的提取及鉴定

1、实实 验验 一一 质粒质粒DNADNA的提取及鉴定的提取及鉴定 背景理论知识背景理论知识 Section 1 掌握质粒信息和用途，学会自己看掌握质粒信息和用途，学会自己看 质粒图谱质粒图谱 掌握快速提取小量质粒掌握快速提取小量质粒DNADNA的方法的方法 了解质粒了解质粒DNADNA提取的基本原理提取的基本原理 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法掌握琼脂糖凝胶电泳的方法 定义：基因工程中携带目的基因进入宿主定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。细胞进行扩增和表达的工具。 类型：大肠杆菌中的质粒、类型：大肠杆菌中的质粒、 噬菌体、噬菌体、M13M13 噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人

2、工噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工 染色体载体及动、植物病毒载体等。染色体载体及动、植物病毒载体等。 l复制子：一段具有特殊结构复制子：一段具有特殊结构的的DNADNA序列，使与序列，使与 之结合的外源基因复制。之结合的外源基因复制。 l可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反 应。应。 l限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基 因的插入。因的插入。 l适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载 体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。 是是染色体外小型

3、的双链环状的染色体外小型的双链环状的DNADNA，常用载体之一，常用载体之一 u自我复制自我复制 u具有合适的限制酶切位点具有合适的限制酶切位点 u筛选标记筛选标记 可编码某些遗传性状可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、如抗药性、耐受重金属、 产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外 的特性的特性 u高拷贝数高拷贝数 u小分子量小分子量1-200Kb 1-200Kb u高稳定性高稳定性 克隆载体克隆载体 表达载体表达载体 原核原核 真核真核 穿梭载体穿梭载体 pGEM-T, pENTR pET28a(+), pGEX, pMAL pcDNA3.

4、0, pEGFP-N3, pRK 根据用途分类根据用途分类 质粒（原核载体）质粒（原核载体） 质粒（真核载体）质粒（真核载体） 1.1.3 1.1.3 质粒提取一般步骤质粒提取一般步骤 细菌培养物的生长 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化 质粒提取的常用方法质粒提取的常用方法 碱解法、碱解法、煮沸法煮沸法（cDNA、pDNA变性、复 性不同） 苯酚抽提法苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺 旋在水相分布） CsClCsCl法法（EB插入造成DNA浮力密度不同） SDS SDS 裂解法裂解法（高盐浓度下大分子沉淀， 质粒在上清） 玻璃纤维膜法玻璃纤维膜法(试剂盒) 1.1.3 1.1.3 质粒提取

5、质粒提取 碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质 粒的方法和技术。 1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体和线性染色体DNA在在 拓扑学上的差异来分离质粒拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽 管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链 仍紧密结合。 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭 合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结 构。通

6、过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等 一起絮状沉淀下来而被除去。 碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA 1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取 实验操作实验操作 Section 2 含质粒载体（含质粒载体（pET28apET28a）和含目的基因质粒）和含目的基因质粒 （pEGFP-N3pEGFP-N3）的大肠杆菌）的大肠杆菌DH5aDH5a 溶液溶液I I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0） 10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8 .0） 溶液溶液IIII 0.4 mol/L NaOH， 2%

7、 SDS（用前等体积混合）（用前等体积混合） 溶液溶液IIIIII 5 mmol/L 乙酸钾 ， 冰乙酸 ，H2O 苯酚：氯仿苯酚：氯仿（2525：2424） 氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇( (2424：1)1) 无水乙醇，无水乙醇， 70%70%乙醇乙醇(-20C保存) TETE缓冲液缓冲液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 胰胰RNARNA酶酶 1 1、细菌培养和收集、细菌培养和收集 将将3ml3ml含含KanKan的的LBLB液体培养基加入到试管中，液体培养基加入到试管中， 接入含质粒的大肠杆菌，接入含质粒的大肠杆菌，3737振荡培养过振荡培养

8、过 夜。（已完成）夜。（已完成） 取取2.5mL2.5mL培养物倒入微量离心管（培养物倒入微量离心管（EPEP管）管） 中中, 10000rpm, 10000rpm离心离心1min1min，吸去培养液。，吸去培养液。 2 2、细菌裂解及质粒的提取、细菌裂解及质粒的提取 将细胞沉淀悬浮于将细胞沉淀悬浮于100ul100ul溶液溶液I I中中, ,充分震荡混匀。充分震荡混匀。 加加200ul200ul溶液溶液IIII( (新鲜配制新鲜配制),),盖紧管盖盖紧管盖, ,轻轻混匀轻轻混匀 内容物内容物, ,将离心管放将离心管放冰上冰上5min5min。 加加150ul150ul溶液溶液III(III(

9、冰上预冷冰上预冷),),盖紧管口盖紧管口, ,轻轻颠轻轻颠 倒倒数次使混匀。数次使混匀。冰上冰上放置放置10min10min。 12000rpm12000rpm离心离心10min,10min,将上清转至另一将上清转至另一EPEP管管（作（作 好标记）好标记）中。中。 l 向上清中加入向上清中加入等体积（等体积（450ul450ul）酚酚: :氯仿氯仿(1:1) (1:1) （注意下层是有机相）（注意下层是有机相）, ,反复混匀。反复混匀。 l 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟分钟, ,将上清将上清小心地小心地转移到另转移到另 一离心管一离心管（标记！）（标记！）中中 l

10、加入加入等体积（等体积（450ul450ul）氯仿氯仿: :异戊醇异戊醇 (24:1),(24:1), 反复混匀。反复混匀。 l 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟，分钟，取上清液于新的取上清液于新的EPEP管管 中。中。 3 3、质、质 粒粒 的的 纯纯 化化 4 4、质粒的浓缩、质粒的浓缩 加入加入2 2倍体积（倍体积（900ul900ul）无水乙醇）无水乙醇, ,混匀后混匀后, , 室温放置室温放置10-15min10-15min。 12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟，分钟，倒去上清液倒去上清液, ,把离心把离心 管倒扣在吸水纸上管倒扣在吸水纸上, ,

11、吸干液体。吸干液体。 用用1ml 1ml 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀沉淀, , 振荡并振荡并 离心离心, 12000rpm, 12000rpm离心离心2 2分钟，倒去上清液分钟，倒去上清液, , 空气中干燥空气中干燥5 510min10min。 5 5、质粒的溶解和保存、质粒的溶解和保存 加加20ul TE20ul TE缓冲液缓冲液, ,其中含有其中含有100ug/ml100ug/ml的胰的胰 RNARNA酶酶, ,使使DNADNA完全溶解。完全溶解。 -20-20保存保存。 样品保存 1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3

12、B1 3B2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 6 6、质粒、质粒DNADNA的电泳检测的电泳检测 （1 1）琼脂糖凝胶的制备）琼脂糖凝胶的制备 每每4 4人人制备一块琼脂糖凝胶（制备一块琼脂糖凝胶（9 9个泳道）个泳道） 0.20.2克琼脂糖克琼脂糖+20+20毫升毫升TAETAE缓冲液，电炉融缓冲液，电炉融 胶（胶（充分溶解充分溶解），稍微冷却加），稍微冷却加 2 2 lgoldviewnalgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，显示液，倒在电泳胶槽中， 使胶凝固使胶凝固(20min)(20min)。 （2 2） 每人每人2 2个样品，个样品，pET28ap

13、ET28a和和pEGFP-N3pEGFP-N3各一个各一个。 取取3 3 l l （记住自己（记住自己 点样位置）点样位置）。 接通电泳仪和电泳槽的电源接通电泳仪和电泳槽的电源( (注意正负极注意正负极) )（ + +） 恒压恒压150V,150V,电泳电泳10-2010-20分钟分钟 紫外灯下观察并记录结果紫外灯下观察并记录结果( (对面实验室拍照片对面实验室拍照片) ) 分析结果。分析结果。 负极负极 正极正极 1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 MarkerMarker l溶液溶液I I加入后充分悬浮加入后充分悬浮 l溶液溶液IIII一次性加入后轻柔地颠倒混匀

14、一次性加入后轻柔地颠倒混匀 l溶液溶液IIIIII加入后轻柔地颠倒混匀加入后轻柔地颠倒混匀 l酚抽提后小心吸取上清酚抽提后小心吸取上清 l无水乙醇和无水乙醇和70%70%乙醇不要弄混乙醇不要弄混 l微量加样器的正确使用微量加样器的正确使用 移液器（排气式和排液式）移液器（排气式和排液式） 1 1选择一支量程合适的移液器选择一支量程合适的移液器 2 2设置移液量设置移液量 3 3装枪头装枪头 4 4检验移液量检验移液量 5 5吸取一定体积的液体吸取一定体积的液体 6 6目测吸入枪头的液体体积是否合理目测吸入枪头的液体体积是否合理 7 7释放液体释放液体 8 8退下枪头退下枪头 实验要求：实验要求： 每人提取质粒每人提取质粒2 2份（份（pET28apET28a和和pEGFP-N3pEGFP-N3各各 一份）一份） 溶液每大组一套溶液每大组一套 枪每枪每2 2人一套人一套 Tips 2Tips 2人一套（人一套（3 3盒）盒） 思思 考考 题题 分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的 特点是什么？特点是什么？ 分离基因组分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA有哪些不同之处？有哪些不同之处？ 核酸分离过程中，酚、氯仿、