《酶的非水相催化》

1、1 o实验设计用酶 o深圳绿微康生物工程有限公司 LVK-H100 ohttp:/ detail-211.html详细介绍 2 Chapter 7 Enzymatic catalysis in Non- aqueous system 酶的非水相催化酶的非水相催化 3 Contents of chapter 7 1、酶催化反应的介质 2、有机介质反应体系 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 Go Go Go Go 5、酶非水相催化的应用 Go 4 1 1 酶催化反应的介质酶催化反应的介质 水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。 但对于大多数

2、有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为 许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反 应的发生。应的发生。 是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？ 5 o1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（Klibanov）等人在有机介质中进行）等人在有机介质中进行 了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化了酶催化反应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催

3、化 作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出作用，获得酯类、肽类、手性醇等多种有机化合物，明确指出 酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应。 Zaks,A.and Kilbanov,A.M(1984),Science224,1249-1251 oZoKs,A. and Kilbanov,A.M.(1985),Proc.Natl,Acad, 82,3192-3196 酶工程除了如在固定化、定点突变、定向进化不断发酶工程除了如在固定化、定点突变、定向进化不断发 展取得进步之外，近展取得进步之外，近20年来最大的突破就是在反应介年来最大

4、的突破就是在反应介 质方面。质方面。 6 酶非水相催化的几种类型 本章 目录 o有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化有机溶剂有机溶剂 o 有机介质中的酶催化是指酶在含有一定 量水的有机溶剂中进行的催化反应。适用于 底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的 酶催化作用。酶在有机介质中由于能够基本 保持其完整的结构和活性中心的空间构象， 所以能够发挥其催化功能。 7 o气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化气相介质气相介质 o 酶在气相介质中进行的催化反应。适用 于底物是气体或者能够转化为气体的物质的 酶催化反应。 由于气体介质的密度低，扩 散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水 溶液中的催化作用有明

5、显的不同特点。 8 o超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化超临界流体超临界流体 o 酶在超临界流体中进行的催化反应。超 临界流体是指温度和压力超过某物质超临界 点的流体。 9 o离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化 o 酶在离子液中进行的催化作用。离子液离子液 （ionic liquids）是由有机阳离子与有机）是由有机阳离子与有机 （无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态 的低熔点盐类的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在 离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区 域选择性、立体选择性、键选择性等显著特 点。 10 2 2 有机介质反应体系有机介质反

6、应体系 o单相共溶体系单相共溶体系与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂 极性较大的有机溶剂与水形成均匀的单相溶 液体系。 酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。 不存在传质障碍。 极性大的溶剂对一般酶的催化活性影响大， 能在该体系反应的酶较少。 不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有机溶剂 和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。和一定量的水。它们都对催化反应有显著的影响。 11 o两相两相/ /多相体系多相体系与水不溶性，非极性有机溶剂与水不溶性，非极性有机溶剂 o由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶

7、性)相所组成的两相体系。 o游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或 产物溶解于有机相 o催化反应在两相界面进行，一般适用于底物或产物两者 或其中一种是属于疏水化合物的催化反应 12 13 14 o微水介质体系微水介质体系非极性有机溶剂非极性有机溶剂 o用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体 酶悬浮在有机相中。但仍然含有必需的结合水 以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。 o酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态， 或者吸附在固体载体表面上。 o有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。 15 o微量的水主要是酶分子的结合水，对于维持 酶分子的空间构象和催化活性至关重要。 o另一

8、有部分水分配在有机溶剂中。 16 o(正正)胶束体系胶束体系 o是在大量水溶液中含有少量与水不溶的有机溶 剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液 滴。 o表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有 机溶剂抱在液滴内部 o反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的 底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界 面中进行。 17 o反胶束体系反胶束体系 o含有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统 o反向微团：疏水尾部向外，与非极性有机溶剂 接触，急性头部向内，形成一个极性核 o反应时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏 水性底物或产物在反胶束外部，催化反应在两 相的界面中进行。 18 19 有机介质酶催化的优

9、点 o有利于疏水性底物的反应：有机溶剂增加了疏水性 底物的溶解度，增加了疏水性物质的转化效率； o可改变反应平衡的移动方向：在有机介质中，可发 生水解反应的逆反应，如氨基酸合成肽 o能催化在水中不能进行的反应：转酯反应；酚氧化 在氯仿中比水中效率高； o防止水引起的副反应发生； o酶稳定性增强，较少微生物污染； o易于实现固定化以及产物和酶的回收 20 6.3 酶在有机介质中的催化特性酶在有机介质中的催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差 别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的 影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性 o底物特异性 o立

10、体选择性 o区域选择性 o键选择性 o热稳定性 o活性 opH 21 底物特异性、立体选择性底物特异性、立体选择性 o有机介质中，酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合 状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。 o有机介质是某些酶的专一性发生变化，是酶活性中心构象刚 性增强的结果。 o酶促反应底物专一性的本质是由于酶能利用其与底物结合能 和酶与水分子之间的结合能的差值 22 23 o从热力学角度看，底物专一性改变的原因是 由于溶剂的改变导致底物在有机溶剂与酶的 活性中心之间的分配系数发生了改变。 o不同的有机溶剂具有不同的极性，故不同的 有机介质中，酶的底物专一性也不一样。 24 o

11、如：枯草芽孢杆菌蛋白酶催化N-乙酰-L-丝氨酸乙 酯和N-乙酰-L-苯丙氨酸乙酯与丙醇的转酯反应。 在二氯甲烷或苯的介质中，含丝氨酸的底物优先反 应；在吡啶或季丁醇中，含苯丙氨酸的底物先发生 转酯反应。 o一般，在极性较强的有机溶剂中，疏水性较强的底 物容易反应；反之。 25 立体选择性 o有机溶剂中酶的立体选择性降低。原因： o1. 在水和有机溶剂中，底物的两种对映体将水从酶分子疏水性结 合位点上置换出来的能力有所不同。 o2. 在疏水性差的溶剂中，疏水性的基团进入酶的疏水袋中比暴露 在溶剂中热力学平衡更为有利，因此酶分子中的亲核基团易于进 攻位置合适的底物分子的羟基，从而得到某个构型的产物

12、。而在 疏水性强的溶剂中，疏水性基团更倾向于暴露在溶剂中，而非进 入酶的疏水袋，从而失去酶对底物的选择性。 o疏水性强的介质中，D-异构体比L-异构体更容易与酶结合反 应。应用于手性药物制造 26 区域选择性 o在酶促反应中，底物某一位置上的基团被选 择性地转化而另一位置上的相同基团没有被 转化的现象 o随溶剂的改变而改变，(溶剂的疏水性改变， 引起区域基团与酶活性中心的改变类似于立 体选择性) 27 键选择性 o与酶的来源和有机介质的种类有关。 o与氢键参数有关，易于形成氢键的基团，不 易进行反应。反之易于反应。 28 活性 o有机溶剂直接作用于酶 o有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高

13、而增大，在某一浓度达到最大值； o低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保 持，但也有某些酶活性亦发生变化。 29 酶活性丧失的原因 30 o热稳定性热稳定性 o酶在缺水的环境中，使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基酶在缺水的环境中，使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基 酸异构化等无法进行，酶构象的刚性增加，稳定性提高。酸异构化等无法进行，酶构象的刚性增加，稳定性提高。 o如：胰脂肪酶催化的反应如：胰脂肪酶催化的反应 o酶在非水介质中的稳定性还与介质中的水含量有关。如酶在非水介质中的稳定性还与介质中的水含量有关。如RNase在在 非水介质中的水含量从非水介质中的水含量从0.06g/g增加到增

14、加到0.2g/g蛋白质时，酶半蛋白质时，酶半 衰期从衰期从120min减少到减少到50min 31 反应体系对酶酯化反应的影响 反应体系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mM，戊酸10 mM，内标正十五烷， 脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应 1：水饱和正已烷10 ml，2pH7.2缓冲液5 ml+正已烷10 ml 32 某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶 介质条件 热稳定性 猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯 水， pH7.0 T1/2 26 h T1/2 2 min 酵母脂肪酶三丁酸甘油酯/庚醇 水，pH7.0 T1/2 =1.5 h T1/2

15、2 min 脂蛋白脂肪酶甲苯，90，400 h活力剩余40 胰凝乳蛋白酶正辛烷，100 水，pH 8.0, 55 T1/2 = 80 min T1/2 = 15 min 枯草杆菌蛋白酶正辛烷，110T1/2 = 80 min 核糖核酸酶壬烷，110，6 h 水，pH 8.0, 90 活力剩余95 T1/2 24 h T1/2 10 min 限制性核酸内切酶 （Hind ） 正庚烷，55，30d活力不降低 -葡萄糖苷酶2-丙醇，50，30 h活力剩余80 溶菌酶环己烷，110 水 T1/2 =140 min T1/2 = 10 min 本章 目录 33 o最适最适pH opH对水相中进行的酶促反

16、应有较大影响，但在有 机相反应体系中，很难直接测定。 o在非水相反应中，酶所处的pH环境与酶在直接干 燥、冻干或吸附到载体之前的缓冲液的pH相同， 即酶对它所在的最后一个水溶液的pH有记忆能力， 从缓冲液中获得的酶在微水体系中可以保持原先 pH环境下的构象，酶的可电离基团在一定的pH中 获得某一电离状态后，将它干燥或冻干后再加入到 微水体系中，还会保持这一状态，从而影响酶在有 机相中的催化活性。 34 6.4 6.4 有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制 o酶在有机介质中可以催化多种反应，主要包括：合成反应、转移反应、 醇解反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应

17、、裂合反应等。 o主要应控制的条件有 n水含量 n酶的种类和浓度 n底物的种类和浓度 n有机溶剂的种类 n温度 npH n离子强度 本章 目录 35 水含量对酶催化反应的影响水含量对酶催化反应的影响 o酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下， 酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质 中进行催化反应时，水是不可缺少的成分水是不可缺少的成分之一。 有机介质中的水含量多少对酶的空间构象空间构象、酶 的催化活性催化活性、酶的稳定性稳定性、酶的催化反应速度催化反应速度 等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和底物和 反应产物的溶解度反应产物的溶解度有关。 36 o酶分子只有在空间构象完整的状态下，才

18、具有催化功能。水分子 通过氢键、疏水作用、范德华力等维持酶分子构象。 o在绝对无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。 o酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。 o维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水 （essential wateressential water）。 o必需水与酶分子结构和性质有密切关系。不同的酶所要求的必需必需水与酶分子结构和性质有密切关系。不同的酶所要求的必需 水的量差别很大。水的量差别很大。 o有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水最适水 含量含量。 37 o辛烷介质中，酶

19、分子糜蛋白酶只需50分子水就可维 持其活性；氯仿中，酶分子多酚氧化酶需要3.5*107 水分子。 o无水条件下，酶分子表面的带电基团和极性基团相互 作用，使得酶构象“锁定失活”。即有机溶剂低介电 常数使得蛋白质基团之间更强的静电作用。 o低于必需水的下限，酶构象变化失活； o在水量增加情况下，酶也会因水分过多而活性降低。 o活性最大：蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性 (柔性)之间达到最佳的平衡点。 38 39 o微水介质体系中含水量 o在有机介质中含有的水，主要有2类 o一类，与酶分子紧密结合的水 o一类，溶解在有机溶剂中的游离水 o一般，最适含水量随着溶剂极性的增加而增 加。 40 o最

20、佳含水量 o通常在有机溶剂中对于酶的催化活性存在一最佳含 水量 o含水量低于最佳值时，酶的构象过于刚性而无法表 现催化活性；含水量高于最佳值时酶的结构柔性较 大，酶的构象趋于向疏水环境中热力学稳定的状态 变化，导致酶结构改变和失活。只有在最佳含水量 时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间达 到最佳平衡点，酶才表现出最大活力。 41 42 有机溶剂对酶催化反应的影响有机溶剂对酶催化反应的影响 o影响途径有3种： o1. 有机溶剂直接与酶作用，通过破坏酶蛋白活 性构象的氢键、疏水作用等，改变酶的构象， 从而抑制酶活或导致酶失活； o2. 影响酶反应过程中的底物和产物的扩散，从 而间接影响酶活性

21、，改变反应平衡点，可进行 在线分离，分出产物或不需要的副产物，使平 衡朝所期望的方向移动。 本章 目录 43 o3. 直接与酶分子周围的水相互作用。 o因而在微水体系中，强极性有机溶剂往往对 酶的催化活性不利，因为会夺取酶表面的必 需水，破坏酶构象。 o所以选择有机溶剂应有一定的疏水性。如酶 在丁醇和十六烷活性不同，后者更稳定。 44 o有机溶剂极性的强弱可用疏水参数lgP表示。 oP值指溶剂在正辛烷和水两相中的分配系数。 疏水参数越大，表明其疏水性越强。 45 o有机溶剂的选择 o选择要适当。极性过强(lgP5)的溶剂，对必需水夺取少，疏水 性底物溶解度也高，但底物难于进入酶分子的必须 水层

22、，催化反应速度也不高。 o选用2lgP5的溶剂作为催化反应介质。 46 o水有机溶剂有甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甘 油、丙酮、乙腈等 o水不溶性有机溶剂：石油醚、乙醚、戊醚、辛 烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，已酯， 二氯甲烷等。 47 酶的种类和浓度 o酶种类：依据反应的类型，如：脂肪酶、蛋 白酶、氧化酶等 o酶形式的选择：冷冻干燥的酶粉、固定化酶、 结晶酶、酶与大分子物质的复合物等 48 o使用载体对酶固定化，所选择载体对酶的微 水环境影响尽可能小。如果酶基本存在于载 体表面，则疏水性载体对酶的固定化有利。 o随着载体亲水性增强，酶的催化活力呈下降 趋势 (亲水基团争夺必需水，导致构想

23、改变)。 提高载体疏水基团含量，可提高固定化酶对 疏水性底物的亲和力，提高反应活性。 49 底物的种类和浓度 o依据酶在所使用有机介质中的专一性选择适 宜的底物 o底物浓度-酶促反应速度 50 温度 o在微水有机介质中，酶促反应的最适温度高 于水溶液中的最适温度 o温度升高，立体选择性下降 51 pH opH记忆 o有机相中最适pH通常与水溶液中相同或接 近 o酶分子从缓冲液中转到有机介质后，酶分子 保留原有的pH印记 o通过调节缓冲液pH，对有机介质中酶催化 的pH值进行调节 52 离子强度 o有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲液中 的离子强度和pH有密切关系 o盐，增加离子强度，可帮助酶维

24、持构象。 o可通过调节缓冲液中离子强度的方法对有机 介质中酶催化的离子强度进行调节控制。 53 6.5 6.5 酶非水相催化的应用酶非水相催化的应用 酶 催化反应 应用 脂肪酶脂肪酶 肽合成 青霉 素G前体肽合成 酯合成 醇与 有机酸合成酯类 转酯 各种 酯类生产 聚合 二酯 的选择性聚合 酰基化 甘醇 的酰基化 蛋白酶 肽合成 合成 多肽 酰基化 糖类 酰基化 羟基化酶 氧化 甾体 转化 过氧化物酶 聚合 酚类 、胺类化合物的聚合 多酚氧化酶多酚氧化酶 氧化 芳香 化合物的羟基化 胆固醇氧化酶 氧化 胆固 醇测定 醇脱氢酶 酯化 有机 硅醇的酯化 54 手性药物的拆分 o手性化合物：化学组成

25、相同，立体结构互为 对映体的两种异构体化合物。 o一种显著疗效，一种弱或无效； o一种显著疗效，一种毒副作用； o两者药效相反；或具有不同的药效；或具有 互补性 55 手性药物两种对映体的药理作用手性药物两种对映体的药理作用 药物名称有效对映体的作用另一种对映体的作用 普萘洛尔（Propranolol） 萘普生（Neproxen） 青霉素胺（Penicillamine） 羟基苯哌嗪(Dropropizine) 反应停（Thalidomide） 酮基布洛芬（Ketoprofen） 喘速宁（Trtoquinol） 乙胺丁醇（Ethambutol） 萘必洛尔（Kebivolol） S构型，治疗心脏病

26、,-受体阻断剂 S构型，消炎、解热、镇痛 S构型，抗关节炎 S构型，镇咳 S构型，镇静剂 S构型，消炎 S构型，扩张支气管 S,S构型，抗结核病 右旋体，治疗高血压,-受体阻断剂 R构型，钠通道阻滞剂 R构型，疗效很弱 R构型，突变剂 R构型，有神经毒性 R构型，致畸胎 R构型，防治牙周病 R构型，抑制血小板凝集 R,R构型，致失明 左旋体，舒张血管 1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映两个对映 体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。许多国家和地区也 都制定了有关手性药物的政策和法

27、规。这大大推动了手性药物拆分的研究和生产应 用。目前提出注册申请和正在开发的手性药物中，单一对映体药物占绝大多数。 56 o手性药物的合成与生产中，除通过不对称合 成的方法得到光学纯的手性化合物外，一般 得到的由等量的对应异构体分子组成的外消 旋体。 o非生物法拆分：利用机械分离法、色谱分离 法、动力学拆分等 o生物法：2个对映体竞争的酶同一活性中性 位置，两者反应速度不同，产生选择性而分 开 57 脂肪酶脂肪酶- -位置选择性酯化反应位置选择性酯化反应 O CH2OH OH OH OH OH +RCH2COOH 吡啶 DMF O CH2 OH OH OH OH RCH2COO 葡萄糖苷-6-

28、O-酰基衍生物是一种可生物降解的非离子表面活性剂， 它可以用脂肪酸和葡萄糖苷在脂肪酶催化下进行选择性酯化得到： 58 糖酯的合成糖酯的合成 59 脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物选择性酯化消旋化合物选择性酯化 + R2OH R R1COOOH R or S R1COOOH R 有机溶剂 脂肪酶 R1COOR2 + HOOH R 潜手性丙二醇 以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸为原料，在有机溶剂介质中用脂肪 酶(CCL)或猪肝酯酶（PLE）催化酯化反应，可得到较高光学纯度的 R-或S-酯。 60 脂肪酶脂肪酶- -消旋化合物的拆分消旋化合物的拆分 乙酸异丙酯 乙酸乙烯醇酯 PSL 消旋化合物 R R

29、 S S + + RCOOCH3 OAc RCOOCH3 OH RCOOCH3 OH RCOOCH3 OAc RCOOCH3 OH 有机溶剂 有机介质中用脂肪酶(PSL)催化酯化用于-羟基-,-不饱和 酯的拆分。可以避免副反应的发生。 61 脂肪酶脂肪酶- -内酯合成反应内酯合成反应 -羟基酸或它的酯在脂肪酶催化下，发生分子内环化作用得到内酯化 合物。内酯可继续反应形成开链寡聚物.内酯化产物形式主要取决于羟 基酸的长度外，也取决于脂肪酶的类型、溶剂及温度等。 62 R = H 或烷基 寡聚物 二聚物 内酯 有机溶剂脂肪酶 有机溶剂 有机溶剂 脂肪酶 脂肪酶 m HO (CH2)n O C OR

30、 O O C(CH2)n O (CH2)n C O (CH2)n O C O(CH2)n O C OH (CH2)n OR O C 63 生物柴油生物柴油 生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生生物柴油是利用生物油脂生产的有机燃料，是由动物、植物或微生 物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可物油脂与小分子醇类经过酯交换反应而得到的脂肪酸酯类物质。可 以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。以代替柴油作为柴油发动机的燃料使用。 生物油脂的来源：菜子油，豆油，椰子油，棕榈油、蓖麻油、棉籽 油，葵花籽 油，废食用油等 优点：优点： （1） 具有良好的环境属性 （2

31、） 具有较好的低温发动机启动性能。 （3） 具有较好的润滑性能。 （4） 具有较好的安全性能。 （5） 具有良好的燃料性能。 （6） 具有可再生性能。 64 从生物质到生物柴油 生物柴油生产装备 65 美国生物柴油发展趋势美国生物柴油发展趋势 66 特性生物柴油常规柴油 冷滤点（CFPP） 夏季产品 ()-100 冬季产品 ()-20-20 20的密度 (g/mL)0.880.83 40动力粘度 (mm2/s)4624 闪点 ()10060 可燃性（十六烷值）5649 热值 (ml/l)3235 燃 烧 功 效 （ 柴 油 =100%），(%)104100 硫含量（w, %0.0010.2 氧