基因组DNA的提取及实验方法

1、一：基因组DNA的提取 采用SDS法，具体步骤如下： 称取2-4克（油菜）叶片，放入研钵中，加液氮后充分研磨。 转入20ml (约样品的一倍体积) DNA提取液中，混匀，65水浴振荡（301-501 rpm）1h左右。 取出冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）混合液，充分混匀 后，置摇床上轻摇一小时。 室温振荡1h左右使之完全混合。 室温3000rpm离心30min。 取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20静置1h后，使DNA沉淀。 钩出DNA，于70%酒精中漂洗2-3次。 挑出DNA，用DNA 真空干燥机真空干燥后，溶于适量TE（pH=8.0）中。DNA纯化：加入适量 10mg

2、/ml RNase，置37 oC 30min，充分降解RNA。再用氯仿-异戊醇抽提一次，DNA沉淀、干燥、溶解程序同上。取适量DNA稀释液与标准浓度DNA同时在1%琼脂糖凝胶电泳上进行DNA定量并检查DNA质量。附：（1）DNA提取液（1000ml） 1M Tris-HCl（PH8.0）100ml0.5M EDTANa2（PH8.0）100ml5M NaCl100ml20% SDS62mlNa Bisufite (Coda S-9000) sigma) 3.8gddH2O 637.5 ml即配即用，充分混匀后调节pH至8.0。（2）50TE（100ml）Tris-HCl 242g冰醋酸 57.

3、1mlEDTA Na218.6g加水至1000ml，灭菌。（3）Tris-HCl pH=8.0 1M 1000mlTris碱 14.1gH2O 800ml浓HCl 49ml混匀充分溶解后，调整pH至8.0，灭菌。PCR反应在10ml体系中进行模板（基因组DNA）1ml（10ng/ml）Primer (R)0.2ml（10uM）Primer (F)0.2ml（10uM）10buffer1mldNTP (2.5mM)0.8mlMgCl2 (25mM)0.8mlTaq酶0.1ml (0.5U)ddH2OH2O5.9ml10mlPCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2ml，混匀，取4ml

4、PCR扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V，电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。PCR扩增条件943min9435 cycles30Sec X（按所用引物确定退火温度）50Sec 721min7210min4保存二：种子贮藏蛋白质样品的提取按Hurkman和Tanaka（1986）的苯酚为基准的总蛋白样品提取方法，并有所改进。将0.5 g成熟种子在液氮中研磨成粉末状，分别加入提取液10mL 50% （v/v）苯酚, 0.45 M 蔗糖, 5 mM EDTANa2, 0.2% （v/v）-巯基乙醇, 50 mM Tris-HCl，pH 8.8，充分混匀后将装有匀浆液的离

5、心管在4条件下，摇床上振荡30 min，然后4 5000 g离心15 min，吸取上清液至新一离心管中加入5倍体积的-20的0.1 M乙酸铵（0.7708 g 乙酸铵溶解在无水的100 mL甲醇中），-20冰箱静置沉淀16 h或过夜。第二天4 5000 g离心10 min，沉淀的蛋白用0.1 M乙酸铵洗涤2次，再用冰冻的80%的丙酮洗1次，最后用70%的乙醇洗涤后，蛋白粉37干燥后，放置-70冰箱保存备用。（接下来要做SDS-PAGE跑垂直胶）SDS-PAGE电泳 按Sambrook等（1989）的SDS-PAGE程序，取适量种子总蛋白样品与2样品缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl

6、，pH 6.8，200 mmol/L DTT，4% SDS，20% Glycerol，0.2% bromophenol blue R)混合，99变性处理10 min后，在8%的分离胶和5%的浓缩胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。使用DYY 212型电泳仪和DYCZ 228C型垂直双板夹芯式电泳槽，电极缓冲液为十二烷基硫酸钠-甘氨酸(pH 8.3) 。每个样品点样15l，室温下40V电压待指示剂到达分离胶与浓缩胶界面时，再调至100 V稳压电泳，待指示剂迁移至凝胶底部后结束电泳。染色和脱色 取下胶后，在染色液（1.0 g考马斯亮蓝R250，450 mL甲醇，100 mL冰醋酸，450 mL 双蒸

7、水）中染色30 min，然后用脱色液（100 mL甲醇，100 mL冰醋酸，800 mL双蒸水）脱色1 d。Rf值及统计蛋白质亚基条带数参照刘敏轩等（2006）的方法，根据电泳结果计算每个实验材料蛋白带的Rf值及统计蛋白质亚基条带数。蛋白质的相对迁移率Rf = 蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。记录样品中产生的多态性蛋白带，同一Rf值位置上有蛋白条带的记为1，无蛋白带记为0。输入计算机，用cluster软件统计分析，根据Main方法构建表征树。三：叶片全蛋白的提取三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法取油菜叶片3-4g放入预冷的研钵中加入液氮研磨成粉后（最好带上一次性手套，避免手直接接触叶片），加入3倍

8、体积的蛋白提取液30mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1mM EDTA，6 mM 抗坏血酸，5 mM MgCl2，1% PVP，0.02% -巯基乙醇，1% 甘油，2%SDS，动作迅速并始终保持4下混匀；转移至1.5ml离心管中，4 15000rpm低温离心15min；将上清液转入另一离心管中，向管中加4体积的10%TCA溶液(10%三氯乙酸中加入0.02% -巯基乙醇，v/v)，混匀，-20静置12h（或过夜，期间间歇一定时间振荡一次）；15000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用80%冷丙酮洗涤三次，最后用冷丙酮-乙醚液（体积1:1）洗涤，沉淀经真空干燥得到粉末状蛋白，-8

9、0冰箱保存备用。蛋白质的溶解称取1mg蛋白样品，在1.5ml离心管中加入350l 水化缓冲液（含7M Urea、2M Thiourea、4% CHAPS、65mM DTT、0.2% Bio-ampholyte, pH310载体两性电解质、0.001% 溴酚兰），冰浴超声波裂解后，在4、8000rpm离心2min, 取上清液待测浓度。采用Bradford法测定样品溶液中蛋白质含量采用 Ramagli 改进的 Bradford（1976）方法，考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要

10、是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。以蛋白质裂解液为空白, 1mg/ml BAS标准蛋白(标准蛋白溶液用蛋白质裂解液配制) 为标准制备标准曲线, 在紫外可见分光光度计上于=595nm 测定用三氯乙酸/丙酮沉淀法所获得油菜蛋白质样品的含量。溶液的配置Bradford储液: 100mg考马斯亮兰G-250 , 50ml 95%的乙醇，100ml 85%的正磷酸，用水定容至1000ml，4保存于棕色瓶中，可使用数周，使用前需要过滤。标准蛋白溶液: 1 mg/ml的BSA溶液：50mg BSA，用水定容至50ml，

11、4保存。标准曲线的制作取0，20，40，60，80，100l不同体积的BSA标准蛋白质溶液（1mg/ml）于6支10ml小试管中，双蒸水调体积到100l，再加入过滤后的5ml Bradford储液，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收值，测量应在1小时内完成。如表5.1所示。表5.1 BSA标准曲线Table 5.1 Standard curve of BSA管号Tube No.BSA标准蛋白溶液（l）BSA standard proteinSolution (l)ddH2O（l）Double distilledwater (l)Bradford储液（ml）Bradford solu

12、tion(ml)吸光值（A595）Absorption value(A595)101005-2208050.03353406050.0618460405023266100050.3275以不同浓度的BSA（mg）为横座标，测得的吸光值A595为纵座标作标准曲线，作图得到一条标准曲线， 根据标准曲线计算样品中蛋白质的含量。四：CTAB法对油菜基因组DNA的提取1) 取油菜植株的新鲜幼嫩叶片组织100mg，液氮冷冻研磨成粉末；2) 将粉末转移至预冷的2m1 Eppendorf离心管中，立即加入65预热的2CTAB提取液700l，涡旋振荡混匀，65温浴30min，期间轻轻颠

13、倒混匀2-3次；3) 混合物冷却至室温后，于4，12,000rpm，离心5min；4) 取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀，室温放置10min；5) 4，12,000rpm，离心5min；6) 重复步骤（4）（5）；7) 取上清液，加入三倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻颠倒混匀至DNA沉淀；8) 4，12,000rpm，离心2min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤两次超净工作台上吹干；加入100l ddH2O（内含20g/ml RNase工作液），过夜溶解沉淀并消化RNA。PCR反应在10ml体系中模板（基因组DNA）1ml（10ng/ml）Primer (R)0.2ml（10mM）

14、Primer (F)0.2ml（10mM）10buffer1mldNTP (2.5mM)0.8mlMgCl2 (25mM)0.8mlTaq酶0.1ml (0.5U)ddH2OH2O5.9ml总体积10mlPCR扩增条件943 min9435 cycles30 s X（按所用引物确定退火温度）50 s 721 min7210 min4保存PCR扩增产物中加入琼脂糖凝胶电泳专用的加样缓冲液2ml，混匀，取4ml PCR扩增产物用1琼脂糖凝胶电泳检测结果。电泳时总电压为120V，电泳1h左右，UV检测扩增产物的多态性。五：（黑色素）黑芝麻色素的测定结果一、黑芝麻色素的色价值测定：配制100mg/L的

15、黑芝麻色素溶液，用0.5NaOH完全溶解，浓度加大后溶解度降低，因此以0.5NaOH做溶剂进行光谱扫描和色价测定，测定结果为在221nm有最大吸收峰，溶液稀释3倍后A值为0.435，但是吸收峰呈一个很平缓升高的坡形，峰不是很明显。0.5%NaOH测定pH在13左右。按照色价吸光度值1/色素浓度（g/mL）的计算公式计算则色价为135。二、黑芝麻色素的体外抗氧化作用评价：1、铁离子还原能力（总抗氧化能力）： 图一 黑芝麻总抗氧化能力与常用抗氧化剂BHT、BHA、Vc的比较2、清除DPPH自由基能力：图二 黑芝麻清除DPPH自由基能力与常用抗氧化剂BHT、BHA、Vc的比较3、清除羟自由基能力：图

16、三 黑芝麻清除羟自由基能力与常用抗氧化剂BHT、BHA、Vc的比较三、黑芝麻色素的光谱扫描的结果：1、0. 5%氢氧化钠溶解的黑芝麻提取物紫外扫描图谱：NOWavelength （nm）Abs1225.001.2182217.504.0003503.500.2054219.500.2705212.000.000 2、 黑芝麻提取物水溶液紫外扫描图谱：取黑芝麻0.05g溶于10ml蒸馏水中，在4000转/分下离心10min取上清液，并于紫外分光光度计下扫描图谱。图谱如下：注：NOWavelengthAbs1280.002.1012222.502.7093214.002.7523、 黑芝麻提取物70乙醇溶液紫外扫描图谱：取黑芝麻0.05g溶于