半枝莲通过线粒体通路诱导小鼠肝癌细胞凋亡

1、半枝莲提取物通过与caspase-3有关 的线粒体通路诱导肝癌细胞H22细 胞凋亡 半枝莲是一种多年生草本植物，在中药中也被称为半枝莲。主要分 布在华南地区，已被用作中国和韩国的肺癌，消化系统癌症，肝癌， 乳腺癌和绒毛膜上皮瘤的抗肿瘤剂以及抗炎药和利尿剂。来自半枝莲 的提取物(ESB)在体外对许多人类癌症（包括白血病，结肠癌，肝癌 和皮肤癌）的生长有抑制作用。然而，其抗肿瘤机制仍不清楚。据报 道，许多中草药具有抗癌特性，可以诱导细胞凋亡凋亡。现已经解决 的三种凋亡途径，包括线粒体途径，死亡受体途径和内质网应激介导 的细胞凋亡途径。 在大多数生理和病理情况下，线粒体通路启动细 胞凋亡。 吴茱萸中

2、二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 背景 在线粒体启动的途径中，经历渗 透性转换的线粒体将线粒体膜间 隔的细胞色素C或细胞凋亡诱导因 子的细胞凋亡蛋白释放到细胞溶 质中。释放的细胞色素C可以激活 caspase-9，并且激活的caspase- 9反过来切割并激活子caspase-3。 caspase-3激活后，caspase-3的 某些特异性底物如聚（ADP-核糖） 和聚合酶（PARP）被切割，最终 导致细胞凋亡。 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 1.实验目的： l 研究半枝莲对肝癌细胞的生长抑制作用和它对肝癌细胞 凋亡的影响 l 确定半

3、枝莲抑制小鼠肝癌细胞H22活性的机制。 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 新鲜牛血清，RPMI-1640培养基，碘化丙啶（PI），二甲基亚砜 （DMSO），核糖核酸酶（RNaseA），罗丹明123（Rh123） ， 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）， 抗caspase-3和细胞色素C的小鼠单克隆抗体。凋亡细胞Hoechst 33258检测试剂盒，荧光探针罗丹明123。体重220-250g的雄性SD 大鼠。 含有血清的药物的制备 使用“血清药理学”来研究药物的体

4、外药理活性。参考以往文献制备含 ESB的血清。20只雄性SD大鼠随机分为对照组，高ESB剂量组，中等 ESB剂量组和低ESB剂量组（n = 5）。高、中、低ESB剂量组的大鼠 以6，3和1.5g/d/kg的计量灌胃给予ESB。对照组大鼠接受生理盐水， 每日2次，共3天。 在最后一次给药两小时后，立即从心脏获得血液， 并在室温下保持4小时。 通过以2400r/min离心10分钟分离血清，用 0.22m醋酸纤维素膜过滤收集两次，在56水中冷冻30分钟，并储 存在-20下使用。 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 3.实验方法与结论， 补 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分

5、析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 MTT法检测H22细胞增殖情况 方法：将H22细胞在96孔板中以5103个细胞/孔的浓度接种，并在 37下生长直到粘附。处理后，加入50g/10L的MTT，将细胞 再孵育4小时。 除去上清液后，向每个孔中加入200LDMSO。 振荡板10分钟后，使用酶标仪（EX-800型）测定90nm波长处的吸 光度，检测细胞活力。 细胞活力（）=实验吸光度组/空白对照组吸光度100。 吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析吴茱萸中二氢吴茱萸新碱的定量分析 3.实验方法与结论 高分辨率透射电子显微镜显示正常的H22细胞是圆形和规则的，在少数 肿瘤细胞中具有染色质边缘（图2A）。在

6、高ESB剂量治疗48小时后，部 分核膜以尖锐的角度向外突出。H22细胞典型的凋亡形态出现如，在高 ESB剂量组（图2B-D）中可以观察到细胞核的色素凝集和碎裂，软骨细 胞肿胀，凋亡体形成。 A：对照组 B：低剂量治疗组 C：中剂量治疗组; D：高剂量治疗组 细胞周期分析 H22细胞以5105个细胞/孔在6孔板中孵育，用同源药物处理48小时。 收集分离和附着的细胞，并在70冰冷的乙醇中于-20固定过夜。 固定后，用PBS洗涤细胞，重悬于含有1mg / mL核糖核酸酶和50g/ mL PI的1mL PBS中，并在37下在黑暗中孵育30分钟。将10 000 个细胞上流式细胞仪分析DNA含量，并用Ce

7、llQuest获取软件分析细 胞周期相分布。 3.实验方法与结论 通过流式细胞术分析ESB对细胞周期的影响。在高ESB剂量组，细胞百 分数在S期显着降低，G1期增加。空白对照组，低，中，高ESB剂量组 细胞凋亡率分别为0.51，1.07，3.15，7.83，差异有统计学意 义（P 0.05）。这些结果表明，高ESB剂量可以诱导G0 / G1期的细胞 周期停滞和H22细胞凋亡。 ESB对线粒体膜电位的影响 在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下用罗丹明123（Rh123）染色 检测线粒体跨膜电位（m）。通过胰蛋白酶消化收集约1106个 细胞，用PBS洗涤2次，并在最终浓度为1L/ mL的Rh123

8、中于37 暗处孵育20分钟，以1000r / min离心5分钟，用培养基洗涤两次，重 悬于培养基中，37培养在含有CO2的培养箱中培养60分钟。在激 光扫描共焦显微镜488nm的激发波长，530nm的发射波长下测定荧 光强度。细胞中罗丹明123的荧光强度代表线粒体膜电位。 3.实验方法与结论 A：对照组 B：低ESB剂量组; C：中ESB剂量组; D：高ESB剂量组。 荧光强度（FI）表明 细胞中线粒体的膜电位 Western blot法分析 在4下以2000r / min离心10分钟收集H22细胞（2.5107），用冷 PBS（pH7.2）洗涤2次，以2000r / min离心10分钟，使用以牛血清 白蛋白为标准的Bio-Rad蛋白测定试剂。通过15SDS凝胶电泳分离 总蛋白（30g/泳道），转移至0.45mPVDF膜。将印迹与所需的一 级抗体一起在以下稀释度下孵育：caspase-3（1：1000），细胞色 素C（1:1500）和-肌动蛋白（1:1500）。随后，将膜与适当的第二 抗体在室温下孵育1小时。如前所述，通过GelDoc 2000系统测定分 析免疫印迹。 3.实验方法与结论 测定caspase-3活性 使用caspase-3活性测定试剂盒测定caspase-3活性。具体操作通过 检测标准样品的吸光度来绘制标