酵母菌的基因工程

1、发展历程 1.1974年rlarckwalker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。 2.1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。 3.1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。 4.我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。 5.1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物酿酒酵母全基因组的测序。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于： 1.安全无毒，不致病； 2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3.容易进行载体D

2、NA的导入。DNA转化技术的不断发展优化， 多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4.培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 缺陷在于： 1.表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。 5.2 .1 酵母菌的宿主系统 1.广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2.提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3.抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵

3、母 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研 究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基 因最理想 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变 突变突变 产生的异源蛋白产生的异源蛋白 增加产量（倍数）增加产量（倍数） 作用位点作用位点 SSC1 凝乳酶原凝乳酶原 Ca2+-ATPase 牛生长因子牛生长因子 3-10 转录后转录后 SSC2 凝乳酶原凝乳酶原 转录后转录后 牛生长因子牛生长因子 rgrl 鼠鼠淀粉酶淀粉酶 5-10 转录后转录后 ose

4、l 内啡肽内啡肽 7-12 转录后转录后 NDS 人血清蛋白人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子溶酶原活化剂抑制因子2型型 10 转录转录 ss1l 1 抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶P 人溶菌酶人溶菌酶 10 羧肽酶羧肽酶Y rho 人溶菌酶人溶菌酶 10 转录转录 人表皮因子人表皮因子 NDE 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心 和外侧糖链两部分组成。 突变类型 生物效应 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型 酵母菌普遍拥有完 整的糖基化系统，但野 生型

5、酿酒酵母对异源蛋 白的糖基化反应很难控 制，呈超糖基化倾向， 因此超糖基化缺陷菌株 非常重要。 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 Lys Lys Ubiquitin 76 aa Lys Lys Ubiquitin ligase E3 Ubiquitin ligase E3 蛋白酶体 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母 UBI4缺陷型： 在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达， UBI4-突变株正常生长，但细胞内游离泛素分子 的浓度比野生株要低的多，因此UBI4缺陷突变 株是外源基因表达理想的

6、受体。 UBA1缺陷型： UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性 的，但其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能 削弱泛素介导的蛋白降解。 Ubc4-ubc5双突变型： 七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同 样有效。 5.2.2 酵母菌的载体系统 载体的一般结构 选择标记 复制子 表达盒 启动子 先导序列 终止子 有用的蛋白结构域 1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建 酵母菌种的野生型质粒 酿酒酵母中的2环状质粒 几乎所有的酿酒酵母 都含有2双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列 600bp，重组FLP编码产 物驱动Irs的同源重组 REP

7、编码产物控制质粒 的稳定性STB REP的结 合位点 接合酵母属中的 pSRI、pSR1、pSB2和 pSR1以及克鲁维酵母属 中的pKD1质粒等，均有 类似的结构。 酵母菌种的野生型质粒 乳酸克鲁维酵母中的线性质粒 乳酸克鲁维酵母中含有两种不同的双链线 性质粒pGKL1和pGKL2，拷贝数为50-100 个，分别携带K1和K2两种能致死宿主细胞的 毒素蛋白基因。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有ARS的YRp和YEp质粒及其构建 ARS为酵母菌中的自主复制序列，大小在0.8- 1.5Kb,染色体上每30-40bp就有一个ARS元件。 由染色体ARS构成的质粒称为Yrp，而由2质粒 构建的杂合质

8、粒为Yep。 上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 200个，但是经过几代培养后，质粒丢失率达 50%-70%，主要由于分配不均匀所致。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有CEN的YCp质粒的构建 CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀 分配有关的序列。将CEN插入到ARS质粒 中，获得的新载体称为YCp。 YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷 贝数通常只有1-5个。 酵母菌克隆表达质粒的构建 含有TEL的YAC质粒的构建 利用酵母菌的端粒TEL.CEN.ARS等DNA元 件构建人工酵母染色体，可以克隆扩增大 片段的外源DNA，这是构建YAC载体的基 本思路 YAC载体的装载量可高达80

9、0kb，适用于构 建人的基因组文库。 5.2.3 酵母菌的转化系统 l酵母菌的转化程序 l转化质粒在酵母细胞中的命运 l用于转化子筛选的标记基因 酵母菌的转化程序 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳 定的原生质球转化法。在Ca2+和PEG的存在下， 转化细胞可达存活的原生质球总数的1%-5%。但 是操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率 的严重制约。 原生质转化法德一个显著特点是，一个受体 细胞可同时接纳多个质粒分子，而且这种共转化 的原生质占转化子总数的25%-33%。 酵母菌的转化程序 碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化 酿酒酵母的碱金属细胞经碱金属离子（如L

10、i+ 等）、PEG热休克处理后，也可高效吸收 质粒DNA，而且具有以下特性： l吸收吸收线性DNA的能力明显大于环状 DNA，二者相差80倍。 l共转化现象较为罕见。 酵母菌的转化程序 酵母菌电击转化 酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条 件下吸收质粒DNA，但在此过程中应避免 使用PEG，它对受电击的细胞具有较大的 负作用。其优势在于不依赖于受体细胞的 遗传特征及培养条件适用范围广，而且转 化率高达105转化子/gDNA。 转化质粒在酵母细胞中的命运 l单双链DNA均可高效转化酵母菌，但单链 DNA的转化率是双链的10-30倍 l含有酵母复制子的单链质粒进入细胞后， 能准确地转化为双链并复制

11、。 l不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高 效地同源整合入染色体，这对于体内定点 突变酵母基因组极为有利。 l同源重组的频率取决于整合型质粒与受体 菌基因组之间的同源程度以及同源区域长 度，一般来说，整合子占转化子总数的50- 80%。 用于转化子筛选的标记基因 营养缺陷型的互补基因 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要由营 养缺陷型互补基因和显性基因两大类。 营养缺陷型互补基因主要由氨基酸和核苷酸 生物合成记忆如：Leu 、Trp、 His、 Lys、 Ura 、Ade。 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的 受体非常困难。 用于转化子筛选的标记基因 显性标记基因 显性标记基因的编码产物只

12、标记基因 编码产物 遗传表型 Aph 氨基糖苷转移酶 抗G418 Cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素 Dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺 Cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子 Suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖 Ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂 5.2.4 酵母菌的表达系统 l酵母菌启动子的基本特征和选择 l酵母菌启动子的可调控表达系统 l外源基因在酵母菌中表达的限制因素 l酵母菌表达系统的选择 酵母菌启动子的基本特征和选择 l用于启动转录蛋白质结构基因的酵母菌 型启动子由基本区和调控区两部分组成， 基本区包括TATA盒和转录起始位点。 l调控区位于基本区上游几百碱基对的区域

13、内，由上游激活系列（UAS）和上游阻遏 序列（URS）等顺式元件组成。 l利用启动子探针质粒可从酵母菌基因组中 克隆和筛选具有特殊活性的强启动子，另 一种方法是从已有的启动子中构建杂合启 动子 酵母菌启动子的可调控表达系统 （1）温度控制性启动 子 酿酒酵母有a和两种 单倍体，分别由 MATa和MAT两种 等位基因决定。 MAT由顺反子 MAT1和MAT2 组成，前者决定1 的激活过程，后者 决定2阻遏过程。 MATa中，a1和a2蛋白 共同决定a1- a2阻 遏。 A 25 Sir3-8ts Sir3-8ts hml2-102 1 a1 MATa MATa a1 hml2-102 受体细胞基

14、因组 重组质粒 a 型 启 动 子 a 型 启 动 子 型 启 动 子 型 启 动 子 酵母菌启动子的可调控表达系统 （2）超诱导型启动子 当酿酒酵母生长在无半乳糖或葡萄糖存在的 培养基时，其GAL1、 GAL7、 GAL10启动 子受到阻遏；加入半乳糖或者葡萄糖时， 启动子活性被诱导1000倍。 酵母菌启动子的可调控表达系统 （3）严紧控制表达系统 一种以人雄激素受体为中心的严紧控制表达 系统能有效地将外源基因的表达水平控制 在一个合适的范围，以弥补酿酒酵母的宿 主-载体系统缺少的严紧控制表达机制 外源基因在酵母菌种表达的限制性因素 l外源基因稳态mRNA的浓度 l外源基因mRNA的翻译活性

15、 l酵母菌对密码子的偏爱性 在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘 油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，磷酸甘油激酶 PKG，乙醇脱氢酶ADH）中96%以上的氨 基酸是由25个密码子编码的。 酵母菌表达系统的选择 酿酒酵母表达系统 酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性 较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸 甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的 启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力， 往往使得有些重组蛋白与受体细胞紧密结合，而 不能大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表 达系统来弥补。 酵母菌表达系统的选择 乳酸克鲁维酵母表达

16、系统 乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广 泛用作重组异源蛋白生产的搞笑表达稳定 性载体，即便在无选择压力的条件下，也 能稳定遗传40代以上。 乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌性的重 组蛋白，性能均优于酿酒酵母表达系统。 酵母菌表达系统的选择 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲 醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径 中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧 化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性 事巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体， 所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色 体DNA上。在此情

17、况下，外源基因的高效表达在 很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。 酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母表达系统 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序 列HARS已被克隆，并用于构建克隆表达载体， 但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载体在受体细胞 有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS质粒能高频自发地整合在受体的染色体 DNA上，甚至可以连续整合100多个拷贝，因此 重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 目前，包括乙型肝炎表卖弄抗原在内的数种外源蛋 白在该系统中成功表达。 酵母菌的蛋白修饰分泌系统 l蛋白质的分泌运输机制 l信号肽及其剪切系统 l分泌型蛋白的糖基化修饰 蛋白质的分泌

18、运输机制 酵母菌的蛋白质分泌系统 与其他高等真 核生物相似， 高度分化的 细胞器结构 在酵母菌蛋 白分泌运输 过程中起着 重要作用。 内质网膜 核膜 高尔基体 泡囊 质膜 信号肽及其剪切系统 与其他真核生物相似，酵母菌信号肽序列的保守性 较低，大都由15-30个氨基酸残基组成，含有三个 不同的结构特征，即N端带正电荷的n区，中间疏 水残基的h区，C端极性的c区。 l n区的长度及氨基酸残基性质各异，都含正电荷。 l h区的疏水氨基酸残基大都随即排列。 l c区具有对应于信号肽剪切位点的特征序列。 分泌型蛋白的糖基化修饰 酵母菌中的蛋白质糖基化修饰有两个主要步 骤，即在内质网内腔中的寡聚多糖核装

19、配 以及在高尔基体中的糖外链延伸。 l进入高尔基体的分泌型蛋白在其寡聚多糖 核上进行外链的延伸反应。 l酵母菌的修饰形式不同于高等真核生物。 l重组异源蛋白在酵母菌受体细胞中的超糖 基化会造成重组蛋白的生物活性降低以及 蛋白质的免疫原性增加等。 利用重组酵母生产乙肝疫苗 l乙肝肝炎病毒的结构与性质、 l产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 l产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒， 具有感染能力的病毒颗粒，直径42nm，基 因组仅为3.2kb。病毒的主要结构蛋白石病 毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它 具有糖基化和非糖基化两种形式

20、，颗粒内 的蛋白成分包括核心抗原、病毒DNA聚合 酶、微量病毒蛋白。 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg， 主要工作包括将S多肽的编码置于ADH1启动子控 制下，转化子能表达出具有免疫活性的重组蛋白， 它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在， 平均颗粒直径为22nm，其结构和形态均与慢性乙 肝病毒携带者血清中的病毒颗粒相同。 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒以作为乙 肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总 蛋白量的1%-2%。 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 利用重组酵母生产

21、人血清蛋白 人血清蛋白是血浆的主要成分，由肝脏合成，并分 泌到血液循环系统中，然后散布于大多数体液中。 l 最初采用的重组人血清蛋白表达分泌系统是酿酒 酵母。 l 进一步的改进方法是使用乳酸克鲁维酵母作为受 体细胞，该菌体杀手毒素蛋白的信号肽能大大提 高表达产物的分泌效率。 l 巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血 清蛋白的表达分泌系统。 酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于： 1.安全无毒，不致病； 2.有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3.容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化， 多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4.培养条件简单，容易进行高密度发

22、酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6.有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。 缺陷在于： 1.表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工 修正。 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心 和外侧糖链两部分组成。 突变类型 生物效应 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och 外侧糖链添加缺陷型 酵母菌普遍拥有完 整的糖基化系统，但野 生型酿酒酵母对异源蛋 白的糖基化反应很难控 制，呈超糖基化倾向， 因此超糖基化缺陷菌株 非常重

23、要。 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用 靶蛋白 靶蛋白 靶蛋白 Lys Lys Ubiquitin 76 aa Lys Lys Ubiquitin ligase E3 Ubiquitin ligase E3 蛋白酶体 酵母菌种的野生型质粒 酿酒酵母中的2环状质粒 几乎所有的酿酒酵母 都含有2双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。 Irs反向重复序列 600bp，重组FLP编码产 物驱动Irs的同源重组 REP编码产物控制质粒 的稳定性STB REP的结 合位点 接合酵母属中的 pSRI、pSR1、pSB2和 pSR1以及克鲁维酵母属 中的pKD1质粒等，均有 类似的结构。 酵母