蛋白质芯片技术

1、蛋白质芯片研究进展蛋白质芯片研究进展 Seminar I 内容提要内容提要 蛋白质芯片概述蛋白质芯片概述 蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用 展望展望 蛋白质芯片的定义蛋白质芯片的定义 生生 物物 芯芯 片片 基因芯片基因芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 微流控芯片微流控芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片, 又称又称蛋白质阵列蛋白质阵列 或或蛋白质微阵列蛋白质微阵列，是指以蛋白质，是指以蛋白质 分子作为配基分子作为配基,将其有序地固定将其有序地固定 在固相载体的表面形成微阵列；在固相载体的表面形成微阵列； 用标记了荧光的蛋白质或其他它用标记了荧光的蛋白质或其他它 分子

2、与之作用，洗去未结合的成分子与之作用，洗去未结合的成 分，经荧光扫描等检测方式测定分，经荧光扫描等检测方式测定 芯片上各点的荧光强度，来分析芯片上各点的荧光强度，来分析 蛋白之间或蛋白与其它分子之间蛋白之间或蛋白与其它分子之间 的相互作用关系。的相互作用关系。 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 54005411. 研究蛋白质芯片的意义研究蛋白质芯片的意义 蛋白质是基因表达的最终产物蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的接近生命活动的 物质层面；物质层面；

3、探针蛋白特异性高、亲和力强探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处可简化样品前处 理，甚至可直接利用生物材料理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞血样、尿样、细胞 及组织等及组织等)进行检测；进行检测； 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； 有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相 互作用。互作用。 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类 Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005

4、, 126 ,161170. 蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的关键技术 提出生物学问题提出生物学问题 （实验目的）（实验目的） 样品预处理样品预处理 （重组蛋白，制备一、二级抗体，重组蛋白，制备一、二级抗体， 荧光标记，配蛋白印记缓冲液）荧光标记，配蛋白印记缓冲液） 生化反应生化反应 化学偶合，加底物，化学偶合，加底物， 反应温度和时间，反应温度和时间， 冲洗条件冲洗条件 检测检测 （荧光和比色扫描或拍照，（荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）参数设置） 数据分析和建模数据分析和建模 （图象量化，标准化，图象量化，标准化， 采集蛋白信息，建立模型）采集蛋白信息，建立模型） 1 12 2 3 3

5、4 4 5 5 蛋白质芯片制备蛋白质芯片制备 6 6 Schena M, Protein microarrays,2005, 7. 蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备 固相载体及其处理固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载载体（滴定板、滤膜、凝胶、载 玻片）玻片） 蛋白质的预处理蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活选择具有较高纯度和完好生物活 性的蛋白进行溶解性的蛋白进行溶解 点制微阵列点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化可使用点制基因微阵列的商品化 点样仪或喷墨法等点样仪或喷墨法等 固定微阵列上的蛋固定微阵列上的蛋 白样点白样点 膜为载体：芯片放入湿盒，膜为载体：芯片放入湿

6、盒， 37C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白基固定蛋白 微阵列的封闭微阵列的封闭 主要封闭试剂：主要封闭试剂：BSA或或Gly 李瑶，基因芯片与功能基因组，李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33. 蛋白质芯片比较蛋白质芯片比较 表面表面 蛋白固定方式蛋白固定方式 优点优点 缺点缺点 PVDF 吸附吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机非特异吸附，分布随机 Nitrocellulose 吸附吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度非特异吸附，高背景

7、，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度，无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机非特异吸附，分布随机 高分辨检测高分辨检测 Epoxy-activated 高密度，高分辨检测高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附分布随机，表面有吸附 PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，高密度，低背景，易与易与SPR或或MS 联用联用 分布随机，制作难，未商品分布随机，制作难，未商品 化化 Avidin coated 亲和结合亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景蛋白连接强度高、特异和高密度，低背

8、景 蛋白需生物素化蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需蛋白需His x6标记标记 表面蛋白分布均一容量表面蛋白分布均一容量 Agarose thin film 制作难，未商品化制作难，未商品化 3D gel pad 吸附，共吸附，共 价偶联价偶联 Poly-lysine coated Aldehyde-coated 共价共价 偶联偶联 扩散扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量无需蛋白修饰过程，高结合容量 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Bio

9、logy,2003,7,55-63. 蛋白质芯片检测蛋白质芯片检测 探针标记检测法探针标记检测法 无探针标记检测法无探针标记检测法 p表面增强激光解吸离子化技术表面增强激光解吸离子化技术 (Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI) p表面等离子体共振检测技术表面等离子体共振检测技术 （surface plasmon resonance, SPR） p原子力显微镜检测技术原子力显微镜检测技术 （atomic force microscope, AFM ） p同位素标记检测同位素标记检测 p荧光标记检测荧光标记检测 p化学发光检测化学

10、发光检测 p酶免疫标记检测酶免疫标记检测 p胶体金标记检测胶体金标记检测 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用 u疾病诊断和预警疾病诊断和预警 u药物开发药物开发 u蛋白质组学蛋白质组学 定量检测组织提取液中的肿瘤标记物定量检测组织提取液中的肿瘤标记物 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436. 孵育后的微阵列荧光图孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原含抗原 B 无抗原无抗原 微阵列方法与微阵列方法与ELISA方法检出结果比较方法检出结果比较 疾病诊断疾病诊断 uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因

11、子血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子血管内皮生长因子 高通量筛选蛋白高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂蛋白作用抑制剂 药物开发药物开发 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431. A 1500 个点阵的微阵列个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及局部点阵放大图及SPR信号信号 His6-RB/GST-E7相互作用抑相互作用抑 制剂筛选微阵列图制剂筛选微阵列图 加入加入His6-RB 加入含加入含 PepC抑制剂的抑制剂的 His6-RB 人动脉平滑肌细胞蛋白谱人动脉平滑肌细胞蛋白谱 Sukhanov S and Delafont

12、aine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280. 蛋白质组学蛋白质组学 揭示了揭示了oxidized low density lipoprotein 诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 细胞经细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱作用后的蛋白谱 检出检出298个蛋白个蛋白 54个蛋白表达量发生变化个蛋白表达量发生变化 4.7% 抗原（一组细胞抗原（一组细胞-细胞间相细胞间相 互作用分子）表达上调；互作用分子）表达上调； 13.4%抗原抗原（结构蛋白，体液响结构蛋白，体液响 应蛋白）表达下降应蛋白）

13、表达下降 存在的问题存在的问题 n成本过高成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器需一系列昂贵的尖端仪器 n芯片的标准化问题芯片的标准化问题 n提高芯片的特异性、简化样品制备和标记提高芯片的特异性、简化样品制备和标记 操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除 芯片背景对于结果分析的影响等等芯片背景对于结果分析的影响等等 展望展望蛋白质芯片未来的发展重点蛋白质芯片未来的发展重点 l 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法， 高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 l 改进基

14、质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异 性结合。性结合。 l 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以 保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 l 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像 与数据分析一体化。与数据分析一体化。 参考文献参考文献 1 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. 2 Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005,

15、272 , 54005411. 3 Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161170. 4 李瑶，基因芯片与功能基因组，李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33 5 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63. 6 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 14271436. 7 Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991. 8 Sukhan

16、ov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 12741280. 9 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 44274431. 10 Schena M, Protein microarrays,2005, 7. 蛋白质芯片检测信号的提高蛋白质芯片检测信号的提高 Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178183. 优化芯片制作过程各种参数；优化芯片制作过程各种参数； 使用金粒子作为辅助标记分子；使用金粒子作为辅助标记分子； 添加添加SiO2和和Ti

17、O2层提高表面反层提高表面反 射射 Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片放大照片 Au 的尺寸及其与的尺寸及其与Dy633的比例的比例 对信对信 号的影响号的影响 n 5 nm Au-particle n10 nm Au-particle. Protein Microarray System The Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis. TeleChem / http:/ It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-p