病毒性肝炎血清学检测的基础与实践

1、南京大学医学院 周乙华 附属鼓楼医院 感染科 病毒性肝炎血清学检测病毒性肝炎血清学检测 的基础与实践的基础与实践 为什么为什么ELISAELISA检测抗体容易假阳性检测抗体容易假阳性 检测抗体和抗原的基本原理检测抗体和抗原的基本原理ELISAELISA 病毒性肝炎血清学检测的基础和实践病毒性肝炎血清学检测的基础和实践 讲讲 解解 内内 容容 甲型肝炎甲型肝炎 乙型肝炎乙型肝炎 丙型肝炎丙型肝炎 丁型肝炎丁型肝炎 戊型肝炎戊型肝炎 4.4.如何克服抗如何克服抗-HEV-HEV检测中的假阳性检测中的假阳性 为什么为什么ELISAELISA检测抗体容易假阳性检测抗体容易假阳性? ? 抗体的粘附特性，

2、特别是抗体的粘附特性，特别是IgMIgM抗体抗体 ELISAELISA的高灵敏性的高灵敏性 抗体结合抗原的适应性：抗体结合抗原的适应性： FabFabCDRCDR 抗抗-HIV -HIV 初筛试验初筛试验 抗抗-HIV -HIV 确诊试验确诊试验 CL VL VH CH1 CH2 CH3 V区区 FabFab段段 FcFc段段 s-s s-s s-ss-s CDR1 CDR3 CDR2 抗体结构简图抗体结构简图 IgMIgM是五聚体，与抗原具有是五聚体，与抗原具有5 5或或1010价结合力。价结合力。 FabFab：fragment antigen-binding fragment antig

3、en-binding CDRCDR：complementarity determining region complementarity determining region FabFab段段 抗体结合抗原的适应性：抗体结合抗原的适应性： FabFabCDRCDR 抗体产生过程简图抗体产生过程简图 间接间接ELISAELISA检测抗体检测抗体 1. 抗原包被抗原包被 2. 封闭封闭 3. 待测血清待测血清 4. 酶标二抗酶标二抗 5. TMB显色显色 6. 2M H2SO4 7. OD450 E EEEEE + Substrate TMB 抗抗-IgG-IgG 抗抗-IgA-IgA 抗抗-Ig

4、M-IgM IgGIgG IgAIgA IgMIgM 抗体的粘附特性抗体的粘附特性 0 0.50 1.00 1.50 2.00 原倍原倍 10100 1000 10000 血清稀释倍数血清稀释倍数 OD450 间接间接ELISAELISA，无抗原包被，无抗原包被 间接法间接法ELISAELISA检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性检测抗体，灵敏，但容易出现假阳性 捕捉法捕捉法ELISAELISA检测检测IgMIgM抗体抗体 1. 抗抗mu链抗体包被链抗体包被 2. 封闭封闭 3. 待测血清待测血清 4. 酶标抗原（特异性）酶标抗原（特异性） 5. TMB显色显色 6. 2M H2SO4 7. OD

5、450 CL VL VH CH1 CH2 CH3 V区区 s-s s-s s-ss-s 敏感性较间接法低，但特异性强敏感性较间接法低，但特异性强 ELISAELISA检测抗原检测抗原 1. 抗体包被抗体包被 2. 封闭封闭 3. 待测血清待测血清 4. 酶标抗体酶标抗体 5. TMB显色显色 6. 2M H2SO4 7. OD450 E EEEEE + Substrate TMB 包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同包被抗体与酶标抗体识别的免疫表位必须不同 病毒性肝炎病毒性肝炎 甲型甲型 乙型乙型 丙型丙型 丁型丁型 戊型戊型 Hepatitis A Virus, HAVHepatitis

6、 A Virus, HAV Hepatitis B Virus, HBVHepatitis B Virus, HBV Hepatitis C Virus, HCVHepatitis C Virus, HCV Hepatitis D Virus, HDVHepatitis D Virus, HDV Hepatitis E Virus, HEVHepatitis E Virus, HEV 消化道消化道 血液血液 消化道消化道 感染途径感染途径 血液血液 血液血液 病原学病原学病程分型病程分型 急性急性 急性急性, , 慢性慢性 急性急性, , 慢性慢性 急性急性, , 慢性慢性 急性急性 GBV-

7、CGBV-C，所谓庚型肝炎病毒，所谓庚型肝炎病毒，不引起肝损，不引起肝损，不是肝炎病毒不是肝炎病毒 EBEB病毒、巨细胞病毒病毒、巨细胞病毒等可引起肝损，但以脏器损伤为主，等可引起肝损，但以脏器损伤为主， 不称肝炎病毒不称肝炎病毒 病毒性肝炎的病原诊断病毒性肝炎的病原诊断 根据临床表现无法确定病原诊断根据临床表现无法确定病原诊断 依赖实验室检查依赖实验室检查 血清学方法：血清血清学方法：血清+ +免疫技术检测抗原或抗体免疫技术检测抗原或抗体 分子生物学：分子生物学： 酶免疫测定：酶免疫测定：enzyme immunoassay, EIAenzyme immunoassay, EIA 酶联免疫吸

8、附测定：酶联免疫吸附测定：enzyme-linked enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA immunosorbent assay, ELISA 分子杂交：同位素或其他物质标记已知分子杂交：同位素或其他物质标记已知DNADNA或或cDNAcDNA，即，即 探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰探针，与待测标本中的核酸互补，特异性结合。淘汰 聚合酶链反应：聚合酶链反应：polymerase chain reactionpolymerase chain reaction，PCRPCR普普 遍使用遍使用 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒 HAVHAV 无包

9、膜无包膜RNARNA病毒：抗原种类少病毒：抗原种类少 正链正链RNARNA，7.4 kb7.4 kb HAVHAV抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展抗原只有一种，即衣壳蛋白；难以测到，不开展 特异性抗体：抗特异性抗体：抗-HAV IgG, IgM -HAV IgG, IgM ，保护性抗体；常用，保护性抗体；常用 HAV RNAHAV RNA：RT-PCRRT-PCR检测，但阳性率低，仅用于研究检测，但阳性率低，仅用于研究 0 02 24 46 68 810101212 抗甲肝抗体浓度 抗甲肝抗体浓度 感染后周数感染后周数 病毒血症病毒血症 大便排病毒大便排病毒 转氨酶升高期转氨酶升高期

10、 症状期症状期 IgMIgM IgGIgG HAVHAV感染后人体抗体应答感染后人体抗体应答 抗抗-HAV IgM-HAV IgM：感染后：感染后3 3周即可阳性，周即可阳性，1-31-3月后转阴，近期或急性感染。月后转阴，近期或急性感染。 抗抗-HAV IgG-HAV IgG：IgMIgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可 能是既往感染，故单独检测抗能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG-HAV IgG通常不用于诊断。通常不用于诊断。 甲型肝炎诊断流程甲型肝炎诊断流程 同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时

11、：时：4 4种情况种情况 仅检测抗仅检测抗-HAV IgM-HAV IgM时时 甲型肝炎甲型肝炎 抗抗-HAV IgM -HAV IgM 阳性阳性 抗抗-HAV IgG -HAV IgG 阳性阳性 甲型肝炎甲型肝炎 1. 1. 2. 2. 既往感染，对甲肝有免疫力既往感染，对甲肝有免疫力 排除甲肝，而且为易感者排除甲肝，而且为易感者 抗抗-HAV IgM -HAV IgM 阴性阴性 抗抗-HAV IgG -HAV IgG 阳性阳性 抗抗-HAV IgM -HAV IgM 阴性阴性 抗抗-HAV IgG -HAV IgG 阴性阴性 3. 3. 阳性阳性 阴性阴性排除排除 甲型肝炎诊断流程甲型肝炎

12、诊断流程 同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况 甲型肝炎早期甲型肝炎早期 或或IgMIgM假阳性假阳性 1-21-2周后复查周后复查 甲型肝炎甲型肝炎甲型肝炎甲型肝炎IgM IgM 假阳性假阳性 排除甲型肝炎排除甲型肝炎 抗抗-HAV IgM -HAV IgM 阳性阳性 抗抗-HAV IgG -HAV IgG 阴性阴性 IgM IgM 阳性阳性 IgG IgG 阳性阳性 IgM IgM 阴性阴性 IgG IgG 阳性阳性 IgM IgM 阳性阳性 IgG IgG 阴性阴性 4. 4. 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒 HBVHBV颗粒颗粒 完整完整

13、HBVHBV： DaneDane particle particle；球形，；球形，42 nm42 nm，双层壳膜结构，双层壳膜结构 小球形颗粒：小球形颗粒：22 nm22 nm，乙肝表面抗原（，乙肝表面抗原（hepatitis B surface hepatitis B surface antigen, antigen, HBsAgHBsAg） 丝状丝状( (管状管状) )颗粒：颗粒：直径直径22 nm22 nm，长短不等，长短不等，HBsAgHBsAg 18.718.7万倍万倍2020万倍万倍2525万倍万倍 HBVHBV双层壳膜结构双层壳膜结构，外层是，外层是HBsAgHBsAg，内层是

14、，内层是HBcAgHBcAg HBVHBV基因与基因产物基因与基因产物 pre-S1pre-S1 pre-S2pre-S2 ORF SORF S ORF PORF P ORF XORF X ORF CORF C pre-Cpre-C + + - - 55 55 HBsAgHBsAg Polymerase:Polymerase: DNA polymeraseDNA polymerase RNase HRNase H Reverse transcriptaseReverse transcriptase othersothers HBxAgHBxAg HBcAgHBcAg HBeAgHBeAg pr

15、e-S1pre-S1pre-S2pre-S2 HBVHBV主要结构示意图主要结构示意图 HBsAgHBsAg HBcAgHBcAg HBV DNAHBV DNA HBeAgHBeAg不是病毒的结构成份不是病毒的结构成份 HBV PreC/CHBV PreC/C基因序列基因序列 1814 atgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgtt catgtcctac 1861 tgttcaagcc tccaagctgt gccttggggg gctttgggac atggacattg 1911 accactataa agaatttgga gcttctgtgg agttac

16、tctc ttttttgcct 1961 tttgacttct ttccttctat tcgagatctc ctcgacaccg cctctgctct 2011 ctatcgagag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag 2061 cactcaggca agctgttctg tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc 2111 tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca tccagggaat tagtagtcgg 2161 ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagaca

17、acta ttggggtttc 2211 acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttctaga gtatttggtg 2261 tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc 2311 ccctatctta tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca 2361 ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg 2411 ccgcgtcgca gaagatctaa atctcgggaa tctcaa

18、tgtt ag MQLFHLCLII SCSCPTVQAS KLCLGGLWDM DIDHYKEFGA SVELLSFLPF DFFPSIRDLL DTASALYREA LESPEHCSPH HTALRQAVLC WGELMNLATW VGSNLEDPAS RELVVGYVNV NMGLKIRQLL GFHISCLTFG RETVLEYLVS FGVWIRTPPA YRPPNAPILS TLPETTVVRR RGRSPRRRTP SPRRRRSQSP RRRRSKSRES QC 147-149 HBV Pre C/C HBV Pre C/C 编码编码 HBcAgHBcAg/ /HBeAgHBe

19、Ag HBcAg: 21.5 kDHBcAg: 21.5 kD HBeAg: 15.5 kDHBeAg: 15.5 kD HBVHBV抗原抗原 55 33 55 33 42 nm42 nm HBsAgHBsAg HBcAgHBcAg HBV DNAHBV DNA HBeAgHBeAg 不是不是HBVHBV本身的成分本身的成分 是是HBcAgHBcAg的裂解产物的裂解产物 能释放到细胞外能释放到细胞外 外周血能测到外周血能测到 能释放到细胞外能释放到细胞外 外周血能测到外周血能测到 不能释放到细胞外不能释放到细胞外 外周血不能测到外周血不能测到 外周血无游离外周血无游离HBV DNAHBV DN

20、A 检测时先裂解检测时先裂解HBVHBV HBVHBV示意图示意图 HBVHBV抗原抗原 55 33 55 33 42 nm42 nm HBsAgHBsAg HBcAgHBcAg HBV DNAHBV DNA HBeAgHBeAg 不是不是HBVHBV本身的成分本身的成分 是是HBcAgHBcAg的裂解产物的裂解产物 能释放到细胞外能释放到细胞外 外周血能测到外周血能测到 能释放到细胞外能释放到细胞外 外周血能测到外周血能测到 不能释放到细胞外不能释放到细胞外 外周血不能测到外周血不能测到 外周血无游离外周血无游离HBV DNAHBV DNA 检测时先裂解检测时先裂解HBVHBV HBVHBV

21、示意图示意图 HBVHBV携带者肝脏每天释放携带者肝脏每天释放10101012 1012病毒 病毒 血液血液HBsAgHBsAg是是HBVHBV的的10001000001000100000倍倍 HBVHBV编码抗原特点编码抗原特点 HBsAgHBsAg 抗抗-HBs-HBs HBsAg+HBsAg+，有传染性，有传染性 HBsAg+ HBsAg+ 和和HBeAg+HBeAg+，传染性强，传染性强 HBsAg HBsAg - -，无传染性，无传染性，除隐匿性感染或变异外除隐匿性感染或变异外 抗抗-HBs+-HBs+，10 mIU/ml10 mIU/ml，有保护力，有保护力 HBeAgHBeAg

22、抗抗-HBe-HBe抗抗-HBc-HBc 乙型肝炎病原学检测乙型肝炎病原学检测 HBV DNAHBV DNA 有条件的开展有条件的开展 抗病毒治疗考核疗效抗病毒治疗考核疗效 乙肝血清学检测结果的意义乙肝血清学检测结果的意义 HBsAg抗抗- HBs HBeAg抗抗- HBe 抗抗- HBc 临床意义临床意义 + +- -+ +- -+ +感染、传染性强感染、传染性强 + +- - -+ + +感染、有传染性感染、有传染性 + +- - -+ +- -感染、有传染性感染、有传染性 + +- - - -+ +感染、有传染性感染、有传染性 + +- -+ +- - -感染、传染性强感染、传染性强 +

23、 + +/-+/-+/-+/-+/-+/-感染、有传染性、病毒感染、有传染性、病毒 可能变异可能变异 + +- - - - -感染潜伏期、有传染性感染潜伏期、有传染性 + +- - - - -接种疫苗后、无传染性接种疫苗后、无传染性 HBs Ag 抗抗- HBs HBe Ag 抗抗- HBe 抗抗- HBc 临床意义临床意义 - -+ +- -+ + +既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力 - -+ +- - -+ +既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力 - -+ +- -+ +- -既往感染已恢复、有保护力既往感染已恢复、有保护力 - -+ +- - - -接种疫苗或

24、既往感染已恢复、接种疫苗或既往感染已恢复、 有保护力有保护力 - - - -+ + +既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力 - - - -+ +- -既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力 - - - - -+ +既往感染已恢复、无保护力既往感染已恢复、无保护力 - - - - - -既往无感染、易感人群既往无感染、易感人群 乙肝血清学检测结果的意义乙肝血清学检测结果的意义 为什么可通过检测外周血抗原诊断为什么可通过检测外周血抗原诊断HBVHBV感染？感染？ HBeAgHBeAg能释放到细胞外能释放到细胞外比较容易测到比较容易测到 HBsAgHBsAg能释放到细胞外能释放

25、到细胞外可测到可测到 HBVHBV携带者肝脏每天释放携带者肝脏每天释放10101012 1012病毒 病毒 血液血液HBsAgHBsAg是是HBVHBV的的10001000001000100000倍倍 其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原，其他病毒复制过程中，缺乏类似特性，不释放游离抗原， 故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。故通常不检测抗原，而通过检测特异性抗体而诊断。 以上原因，决定了诊断以上原因，决定了诊断HBVHBV感染可通过检测病毒抗原。感染可通过检测病毒抗原。 容易测到容易测到 抗抗-HBc-HBc的意义的意义 抗抗-HBc IgG-HBc IgG：长期存在，

26、阳性时如：长期存在，阳性时如HBsAgHBsAg阴性，既往感染阴性，既往感染 抗抗-HBc IgM-HBc IgM：短期存在，：短期存在，阳性时，通常阳性时，通常HBsAgHBsAg也阳性也阳性； 见于急性感染或慢性携带者急性发作见于急性感染或慢性携带者急性发作 实际工作中，抗实际工作中，抗-HBc-HBc阳性具有传染性阳性具有传染性 基本不正确基本不正确 抗抗-HBc IgM-HBc IgM具有传染性正确具有传染性正确 目前检测的抗目前检测的抗-HBc-HBc是总抗体，包括是总抗体，包括IgGIgG、IgMIgM等，只要等，只要IgGIgG阳阳 性，抗性，抗-HBc-HBc即阳性；多数情况下

27、，抗即阳性；多数情况下，抗-HBc-HBc阳性仅是阳性仅是 IgGIgG抗体抗体 阳性。阳性。 正确正确HBsAgHBsAg阳性具有传染性阳性具有传染性 HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性阳性HBVHBV携带者携带者 March 2008October 2008January 2009 HBsAg (IU/ml)- - - ( (0.01) )- - ( (0.00) ) 抗抗-HBs (mIU/ml)+ + + ( (5356) )+ + ( (11578) ) HBeAg + + + ( (72.78) )+ + ( (72.89) ) 抗抗-HBe- - -

28、( (4.33) )- - ( (4.28) ) 抗抗-HBc+ + + ( (11.89) )+ + ( (15.91) ) 抗抗-HBc IgMnot done- - - ALT (U/L)21.024.221.5 HBV DNA (copies/ml) not done+ + ( (491) )+ + ( (370) ) HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性携带者新的阳性携带者新的S S基因变异基因变异 PCRPCR产物测序产物测序 克隆后测序克隆后测序 pre S2 gene HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性携带者前阳性携带者前S

29、2S2基因序列基因序列 PCRPCR产物测序产物测序 克隆后测序克隆后测序 HBsAg(HBsAg()HBeAg(+)HBeAg(+)阳性阳性HBVHBV携带者携带者 IF 3.124 具有研究价值的具有研究价值的HBVHBV标本标本 HBsAgHBsAg抗抗-HBs-HBsHBeAgHBeAg抗抗-HBe-HBe抗抗-HBc-HBc研究内容研究内容 + + +/-+/-+/-+/-+/-+/-变异变异 + +- - - - -转归转归 + +- -+ +- - -转归转归 + +- - -+ +- -？抗？抗c c阴性阴性 - -+ +- -+ +- -？抗？抗c c阴性阴性 - -+ +-

30、 - - -？抗？抗c c阴性阴性* * - - - -+ +- -？抗？抗c c阴性阴性 *未接种疫苗，即自然感染除外。未接种疫苗，即自然感染除外。 丙型肝炎病毒丙型肝炎病毒 HCVHCV HCV 30-60 nmHCV 30-60 nm 有有包膜的包膜的RNARNA病毒病毒，核心含有，核心含有核心蛋白和核心蛋白和RNARNA单链正义单链正义 HBVHBV HCVHCV抵抗力弱，且抵抗力弱，且RNARNA容易降解，检测核酸时，标本容易降解，检测核酸时，标本 需在需在3030分钟内分离血清，分钟内分离血清，-80-80 C C保存。保存。 Lipid layerLipid layer 脂质层脂

31、质层 Core, Core, 核心蛋白核心蛋白 E1, E1, 包膜蛋白包膜蛋白1 1 E2, E2, 包膜蛋白包膜蛋白2 2 RNA, RNA, 病毒核酸病毒核酸 直径直径 30-60 nm30-60 nm 结构蛋白结构蛋白 HCVHCV结构简图结构简图 糖基化蛋白糖基化蛋白 HCVHCV示意图示意图 HCVHCV基因与基因产物基因与基因产物 hypervariable region 1, HVR1hypervariable region 1, HVR1 Untranslated Region, UTR Untranslated Region, UTR Noncoding region, N

32、CR Noncoding region, NCR 针对针对HCVHCV所有所有抗原的抗体都抗原的抗体都没有没有证实有证实有中和作用中和作用 HVR1 38 clones 15 sequences HCVHCV高度变异高度变异 HVR1HVR1 抗原检测抗原检测 HCV core: HCV core: 仅用于研究仅用于研究 抗抗-HCV IgM-HCV IgM：一般不开展，阳性率低：一般不开展，阳性率低 HCV RNAHCV RNA：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效：有条件的开展；抗病毒治疗考核疗效 抗抗-HCV IgG-HCV IgG：开展开展，(+)(+)通常表示有通常表示有HCVHCV感染

33、感染 HCVHCV病原学诊断病原学诊断 针对针对HCVHCV所有所有抗原的抗体都抗原的抗体都没有没有证实有证实有中和作用中和作用 抗抗-HCV IgM-HCV IgM：一般不开展：一般不开展 抗抗-HCV IgG-HCV IgG：开展开展，90-9590-95的的(+)(+)提示提示HCVHCV感染感染 HCVHCV病原学诊断抗病原学诊断抗-HCV-HCV检测检测 包被抗原包被抗原 1st1st代代 3rd3rd代代 2nd2nd代代 50-75%50-75% 90-95%90-95% 95-99%95-99% 阳性率阳性率 丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒 HDVHDV Deltavirus gen

34、usDeltavirus genus中的唯一病毒中的唯一病毒 HDV, 36 nmHDV, 36 nm HDV RNA, 1.7 kbHDV RNA, 1.7 kb 缺陷病毒，必须有缺陷病毒，必须有HBsAgHBsAg HDAgHDAg：仅用于研究：仅用于研究 抗抗-HD IgM-HD IgM：( () )近期感染近期感染 抗抗-HD IgG-HD IgG：( () )感染感染 HDV RNAHDV RNA：仅用于研究：仅用于研究 HDVHDV病原学检测病原学检测 仅在仅在HBsAgHBsAg阳性人群中检测才有意义：阳性人群中检测才有意义： 戊型肝炎病毒戊型肝炎病毒 HEVHEV 属于属于fa

35、mily family HepHepe eviridae, genus Hepevirusviridae, genus Hepevirus HEV, 30-32 nmHEV, 30-32 nm 无包膜：抗原种类少无包膜：抗原种类少 新的新的HEVHEV发现：兔发现：兔HEVHEV王佑春等王佑春等 HEVHEV基因及其蛋白基因及其蛋白 ORF1 ORF3 ？ ORF2 5 3 核衣壳核衣壳 CapsidCapsid 非结构蛋白非结构蛋白 结构蛋白结构蛋白 主要抗原决定簇主要抗原决定簇 中和免疫中和免疫 459607 核酸：核酸：单链正义单链正义RNARNA，7.2 kb7.2 kb 024681

36、01214 转氨酶升高期转氨酶升高期 症状期症状期 IgM IgG病毒血症病毒血症 大便排病毒大便排病毒 抗戊肝抗体浓度 抗戊肝抗体浓度 感染后周数感染后周数 HEVHEV感染后人体抗体应答与感染后人体抗体应答与HAVHAV类似类似 抗抗-HEV IgM-HEV IgM：感染后：感染后3 3周即可阳性，周即可阳性，1-31-3月后转阴，近期或急性感染。月后转阴，近期或急性感染。 抗抗-HEV IgG-HEV IgG：IgMIgM产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可产生后数天即可阳性，存在数十年，单纯阳性很可 能是既往感染，故单独检测抗能是既往感染，故单独检测抗-HAV IgG-HAV

37、IgG通常不用于诊断。通常不用于诊断。 HEVHEV抗原：一般不开展，仅用于研究抗原：一般不开展，仅用于研究 HEVHEV病原学检测病原学检测与甲肝类似与甲肝类似 抗抗-HEV IgM-HEV IgM：( () )近期感染近期感染 抗抗-HEV IgG-HEV IgG：双份血清：双份血清 HEV RNAHEV RNA：一般不开展，仅用于研究：一般不开展，仅用于研究 HEVHEV病原诊断抗病原诊断抗-HEV-HEV 同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况 仅检测抗仅检测抗-HEV IgM-HEV IgM时时 戊型肝炎戊型肝炎 抗抗-HEV Ig

38、M -HEV IgM 阳性阳性 抗抗-HEV IgG -HEV IgG 阳性阳性 戊型肝炎戊型肝炎 1. 1. 2. 2. 既往感染，对戊肝有免疫力既往感染，对戊肝有免疫力 排除戊肝，而且为易感者排除戊肝，而且为易感者 抗抗-HEV IgM -HEV IgM 阴性阴性 抗抗-HEV IgG -HEV IgG 阳性阳性 抗抗-HEV IgM -HEV IgM 阴性阴性 抗抗-HEV IgG -HEV IgG 阴性阴性 3. 3. 阳性阳性 阴性阴性排除排除 同时检测抗同时检测抗HAV IgMHAV IgM和和IgGIgG时：时：4 4种情况种情况 戊型肝炎早期戊型肝炎早期 或或IgMIgM假阳性

39、假阳性 1-21-2周后复查周后复查 戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎戊型肝炎IgM IgM 假阳性假阳性 排除戊型肝炎排除戊型肝炎 抗抗-HEV IgM -HEV IgM 阳性阳性 抗抗-HEV IgG -HEV IgG 阴性阴性 IgM IgM 阳性阳性 IgG IgG 阳性阳性 IgM IgM 阴性阴性 IgG IgG 阳性阳性 IgM IgM 阳性阳性 IgG IgG 阴性阴性 4. 4. HEVHEV病原诊断抗病原诊断抗-HEV-HEV 抗抗-HEV-HEV检测试剂质量差异很大检测试剂质量差异很大( (国外国外) ) 方方 法法 种类种类抗抗 原原 ORFORF来源来源病毒病毒+ +血血66

40、6月月 2020例例 - -血清血清 2222例例 1 1EIAEIAR R2 2昆虫昆虫巴基巴基9 918180 0 2 2EIAEIAR R2 2昆虫昆虫缅甸缅甸9 920200 0 3 3WBWBR R2 2昆虫昆虫缅甸缅甸9 920201 61 6 4 4WBWBR R2,32,3大肠大肠中国中国8 819190 10 1 5 5EIAEIAR R2 2大肠大肠缅甸缅甸 9 919190 0 6 6EIAEIAR R2,32,3大肠大肠缅缅, ,墨墨5 514140 0 7 7EIAEIAR R2,32,3大肠大肠缅缅, ,墨墨9 917170 0 8 8EIAEIAR R2,32,3

41、大肠大肠缅缅, ,墨墨6 614 114 10 0 9 9EIAEIAS S3 3缅甸缅甸1 11 15 25 2 1010EIAEIAS S2 2缅甸缅甸7 17 13 63 60 0 11 11EIAEIAS S3 3缅缅, ,墨墨2 22 20 0 1212EIAEIAS S2,32,3缅缅, ,墨墨6 610100 0 Hepatology 1998;27:857-861.Hepatology 1998;27:857-861. 1212种检测方法早期康复期血清抗种检测方法早期康复期血清抗-HEV-HEV滴度滴度 Hepatology 1998;27:857-861.Hepatology

42、 1998;27:857-861. WBWB 昆虫昆虫 大肠杆菌大肠杆菌合成肽合成肽 抗抗-HEV IgG-HEV IgG诊断试剂阳性率比较诊断试剂阳性率比较( (国内外国内外) ) 厂商厂商结果结果 明确人群明确人群 ( (符合率符合率%)%)总符合总符合 率率% 230230例普通人例普通人 群群 (%)(%) 患者患者2424例例非患者非患者3030例例 万泰万泰 + +23 (95.83)23 (95.83)1 (3.33)1 (3.33) 96.3096.30 7373 (31.74) (31.74) - -1 (4.17)1 (4.17)29 (96.67)29 (96.67) 高

43、达高达 + +21 (21 (87.5087.50) )0 0 94.4494.44 40 40 (17.39)(17.39) - -3 (12.50)3 (12.50)30 (100)30 (100) 华美华美 + +21 (21 (87.5087.50) )1 (3.33)1 (3.33) 92.5992.59 55 55 (23.91)(23.91) - -3 (12.5)3 (12.5)29 (96.67)29 (96.67) GeneLabGeneLab + +16 (16 (66.6766.67) )0 0 85.1885.18 18 18 (7.83)(7.83) - -8 (3

44、3.33)8 (33.33)30 (100)30 (100) 科华科华 + +11 (45.83)11 (45.83)0 0 75.9375.93 8 8 (3.48)(3.48) - -13 (54.17)13 (54.17)30 (100)30 (100) 不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。不同试剂检测结果偏差很大，尤其在血清流行病学调查。 中华实验和临床病毒学杂志 2007;21(1):59-61. 抗抗-HEV IgM-HEV IgM 抗抗-HEV IgG-HEV IgG 检测方法存在一定假阳性和假阴性检测方法存在一定假阳性和假阴性 607-660 ORF21-1114

45、58-607 ORF3-E ORF3-S 1123 91123 ORF3 6601 主要抗原决定簇主要抗原决定簇 GeneLabs GeneLabs 试剂的抗原，间接法试剂的抗原，间接法 J Virol Methods 1992;38(1):17586. 包被抗原包被抗原 ORF2 ORF3 1 1和和2 2型、合成肽和细菌表达型、合成肽和细菌表达 灵敏度和特异性低灵敏度和特异性低 ORF2ORF2衣壳蛋白，衣壳蛋白，72 kDa72 kDa 国产抗国产抗-HEV-HEV试剂盒所用抗原试剂盒所用抗原 万泰公司抗原：万泰公司抗原： IgMIgM，包被，包被mumu链，酶标抗原链，酶标抗原 IgG

46、IgG，包被抗原，酶标二抗，包被抗原，酶标二抗 394606 1660 特异性高特异性高 灵敏度较高灵敏度较高 458-607 高达试剂：合成肽？高达试剂：合成肽？ 同时包括了同时包括了ORF2 ORF2 和和ORF3ORF3多肽抗原，具体不详？多肽抗原，具体不详？ 首都公共卫生首都公共卫生2007;1(4):168-170. 华美公司和科华公司：华美公司和科华公司： 灵长动物实验感染后灵长动物实验感染后 抗抗-HEV IgM-HEV IgM和和IgGIgG应答应答 Yu, et al. CGLI 2003 急性戊肝病人抗急性戊肝病人抗-HEV IgM-HEV IgM和和IgGIgG应答应答

47、Seriwatana, et al. CGLI 2002 如何提高戊型肝炎诊断的准确性？如何提高戊型肝炎诊断的准确性？ 急性急性HEVHEV感染，发病时抗感染，发病时抗-HEV IgM -HEV IgM 和和 IgG IgG 通常同时阳性通常同时阳性 确诊确诊 同时检测抗同时检测抗-HEV IgG-HEV IgG和和IgMIgM IgGIgG IgMIgM IgGIgG IgMIgM IgGIgG IgMIgM IgGIgG IgMIgM 1 12 2周后周后 复查复查 排除排除 既往感染既往感染 IgGIgG IgMIgM IgGIgG IgMIgM IgGIgG IgMIgM 确诊确诊 假

48、阳性假阳性 假阳性假阳性 Ch1374 (Sar-55, I) A450 Ch1375 (Sar-55, 1) 458-607 1660 112-607 0.0 0.5 3.0 3.5 0246810 13 15 17 112-607 458-607 475-607 475-607 Ch1374 (Sar-55, 1) 感染后周数感染后周数 感染后周数感染后周数 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 0246810 13 15 17 112-607 458-607 475-607 A450 1.0 1.5 2.0 2.5 利用利用抗原主要决定簇多肽抗原主要决定簇多肽的

49、的高反应性高反应性检测阳性标本检测阳性标本 利用利用抗原主要决定簇截短肽抗原主要决定簇截短肽的的无反应性无反应性排除假阳性排除假阳性 如何提高戊型肝炎诊断的准确性？如何提高戊型肝炎诊断的准确性？ 表达载体 HEV ORF2 1660 459 459 607 594 ORF2 ORF2 多肽的蛋白表达多肽的蛋白表达 472607 将重组质粒导入大肠杆菌将重组质粒导入大肠杆菌 1 2 3 1 2 3 1 2 3 459-607 459-594 472-607 kDa 36 22 16 ORF2多肽多肽 大肠杆菌表达大肠杆菌表达ORF2多肽多肽 SDS-PAGE电泳结果电泳结果 459-607 45

50、9-594 472-607 459-607 459-594 472-607 kDa 36 22 16 50 二聚体二聚体 单体单体 SDS-PAGE加样缓冲液加样缓冲液 煮沸煮沸 5 min5 min不加热不加热 ORF2多肽的多肽的二聚体特性二聚体特性 SDS-PAGE电泳结果电泳结果 36 22 二聚体二聚体 单体单体 抗抗-His6-His6抗抗-HEV-HEV抗抗-HEV-HEV 459-607 459-594 472-607 459-607 459-594 472-607 459-607 459-594 472-607 抗抗-HEV-HEV仅与仅与ORF2ORF2多肽二聚体反应多肽二聚体反应 1660 459 459 607 594 472607 + + - - - - kDa Western blotting 蛋白免疫印迹结果蛋白免疫印迹结果 ORF2 点突变对点突变对459-607459-607多肽二聚体的影响多肽二聚体的影响 595562580476 二聚体二聚体单体单体 SDS-PAGEWestern