蛋白质的重要性质

1、 （一）胶体性质（一）胶体性质 分子量大，在水中不能成真溶液，成胶体分子量大，在水中不能成真溶液，成胶体 溶液溶液 透析透析：蛋白质溶液放入半透膜内放入水中：蛋白质溶液放入半透膜内放入水中 让其中杂质扩散入水内让其中杂质扩散入水内 （二）两性解离（二）两性解离 末端末端自由自由-COOH和自由和自由-NH2 链中可解离的链中可解离的侧链基团侧链基团（-NH2，-COOH，胍，胍 基，咪唑基等）基，咪唑基等） -NH3+ -COOH P -NH3+ -COO- P -NH2 -COO- P +H+ -H+-H+ +H+ 正离子正离子 两性离子两性离子 负离子负离子 等电点（等电点（pI） 蛋白质

2、自身净电荷为零时溶液的蛋白质自身净电荷为零时溶液的pH值值 并不是蛋白质并不是蛋白质自身电荷数自身电荷数最小时最小时 必须在一定离子强度的必须在一定离子强度的缓冲液缓冲液中测定，等电中测定，等电 点与缓冲液的种类、缓冲液的离子强度有关。点与缓冲液的种类、缓冲液的离子强度有关。 蛋白质在不含任何其它溶质的纯水中的等电蛋白质在不含任何其它溶质的纯水中的等电 点称点称等离子点等离子点 蛋白质的等电点一般蛋白质的等电点一般偏酸偏酸 等电点时，蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度、导电性、粘度、溶解度、导电性、粘度、 渗透压最小渗透压最小 电泳现象电泳现象 带电荷的蛋白质离子在电场中向带相反电带电荷的蛋白质

3、离子在电场中向带相反电 荷的电极移动荷的电极移动 （三）变性和凝固（三）变性和凝固 变性作用变性作用 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，分子天然蛋白质受物理或化学因素的影响，分子 内部原有的高度规则性的空间排列发生变化，致内部原有的高度规则性的空间排列发生变化，致 使原有性质和功能发生部分或全部丧失，称使原有性质和功能发生部分或全部丧失，称变性变性 作用作用。 变性的蛋白质分子相互凝集为固体的现象称变性的蛋白质分子相互凝集为固体的现象称凝固凝固 变性的可逆性 变性因素及其作用机制变性因素及其作用机制 热变性热变性 破坏氢键破坏氢键 酸碱酸碱 破坏盐键破坏盐键 有机溶剂有机溶剂 降低介电常数；破

4、坏疏水键降低介电常数；破坏疏水键 尿素、胍尿素、胍 破坏氢键及疏水键破坏氢键及疏水键 三氯乙酸三氯乙酸 与蛋白质形成溶解度很小的盐与蛋白质形成溶解度很小的盐 振荡振荡 表面作用表面作用 变性蛋白质的特征变性蛋白质的特征 结晶和生物活性消失结晶和生物活性消失 溶解度显著减小溶解度显著减小 粘度、旋光性增加，粘度、旋光性增加，pIpI提高提高 反应基团数目增加反应基团数目增加 易被酶消化易被酶消化 变性的理论变性的理论 中国科学家中国科学家 吴宪吴宪 19311931年年 变性蛋白质其肽链由原来的变性蛋白质其肽链由原来的紧密有序紧密有序的构象的构象 变成变成松散无序松散无序的构象的构象 别构作用别

5、构作用( (变构作用变构作用) ) 概念概念 含亚基的蛋白质由于一个亚基构象的改含亚基的蛋白质由于一个亚基构象的改 变而引起其余亚基和整个分子构象、性质、变而引起其余亚基和整个分子构象、性质、 功能发生改变的作用称别构作用功能发生改变的作用称别构作用 血红蛋白的别构作用血红蛋白的别构作用 沉淀作用沉淀作用 加酸加酸 盐析盐析 有机溶剂有机溶剂 加重金属盐加重金属盐 生物碱试剂生物碱试剂 抗原抗体反应抗原抗体反应 加热加热 沉降作用沉降作用 高速离心时，蛋白质分子趋于下沉高速离心时，蛋白质分子趋于下沉 沉降速率沉降速率 沉降常数沉降常数(s) 每单位引力场沉降分子下沉的速度每单位引力场沉降分子下

6、沉的速度 1 Svedberg单位单位110-13 sec (一一) 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构 牛胰RNase变性一复性实验： 124个a.a残基 4个链内二硫键。 分子量：12600 (8M尿素+硫基乙醇)变性、失活透析后构象恢复， 活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。 ( (二二) )蛋白质一级结构与生物功能的关系蛋白质一级结构与生物功能的关系 细胞色素细胞色素C的种属差异与生物进化的种属差异与生物进化 镰状细胞贫血病的血红蛋白镰状细胞贫血病的血红蛋白HBS 链的第链的第6个氨基酸个氨基酸GluVal 酶原和激素原的激活酶

7、原和激素原的激活 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 同源蛋白质：同源蛋白质： 在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。 如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能， 细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。 同源蛋白质的特点： 同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同 源性） 有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称 不变残基，不变残基高度保守，是必需的。 除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很 大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变 化不影响蛋白质的功能。 多肽链长度相同或相近 通过比较同源蛋白质的氨基

8、酸序列的差异 可以研究不同物种间的亲源关系和进化。 亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差 异就越大。 1、 细胞色素细胞色素C 分子量：12500左右 氨基酸残基：100个左右，单链。 25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。 60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。 亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。 亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。 人与黑猩猩 0 人与猴 1 人与狗 10 人与酵母 44 2、胰岛素胰岛素 有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定 蛋白质的空间结构起重要作用。 其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空间结构

9、作用不大， 但对免疫反应起作用。 猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛 素治疗人的糖尿病。 蛋白质一级结构的突变蛋白质一级结构的突变分子病分子病 分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸 残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改 变，功能部分或全部丧失。 镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的 链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val 正常人血红蛋白，.N.Glu 6 镰刀型贫血 .N.Val 6 生理条件下电荷： Glu- Va10 亲水 疏水 一级结构的部分切除与蛋白质的激活一级结构的部分切除与蛋白质的激活 1、 血液凝固的机理血

10、液凝固的机理 凝血因子（凝血酶原致活因子） 凝血酶原 凝血酶 纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶 （1）、）、 凝血酶原凝血酶原 在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶 原分子中的Arg274Thr275、 Arg323Ile324断裂，释放出48个a.a， 产生活性凝血酶。 A链49 a.a B链259 a.a （2）、）、 纤维蛋白原纤维蛋白原 22r2 从二条链和二条链的N端各断裂一个特定的肽键-ArgGly-， 释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基 酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。 A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子 间聚集，形成网状结构。 在凝血因子

11、XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋 白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的 纤维蛋白。 2、 胰岛素原的激活胰岛素原的激活 前胰岛素原，含信号肽。 胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。 活性胰岛素，高尔基体，切除C肽。 指天然的或人工的对组成蛋白质的氨基酸残指天然的或人工的对组成蛋白质的氨基酸残 基或基团作某些改变从而改变蛋白质的有关性基或基团作某些改变从而改变蛋白质的有关性 质与功能质与功能 羟基氨基酸羟基氨基酸(Ser,Thr,Tyr)的的磷酸化磷酸化与与去磷酸化去磷酸化 糖蛋白糖蛋白 短链糖同蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白质短链糖同蛋白质以共价键连接而成

12、的结合蛋白质 糖与蛋白质的连接键糖与蛋白质的连接键 O-糖苷键糖苷键 糖的半缩醛羟基与糖的半缩醛羟基与Thr,Ser,Hypro,Hylys的羟基的羟基 N-糖苷键糖苷键 糖的半缩醛羟基与糖的半缩醛羟基与Asn的氨基的氨基 脂蛋白脂蛋白 脂质同蛋白质以次级键结合脂质同蛋白质以次级键结合 脱辅基蛋白脱辅基蛋白(载脂蛋白载脂蛋白 apo ) 脂质脂质 细胞脂蛋白细胞脂蛋白 血浆脂蛋白血浆脂蛋白 v乳糜微粒乳糜微粒 v极低密度脂蛋白极低密度脂蛋白(VLDL) v低密度脂蛋白低密度脂蛋白(LDL) v高密度脂蛋白高密度脂蛋白(HDL) 低密度脂蛋白低密度脂蛋白(LDL) 抗体抗体(Ig)， -球蛋白球

13、蛋白 分分5类，类，IgA, IgD, IgE, IgG, IgM L 轻链轻链 H 重链重链 V Variable C Constant 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 切割位点切割位点 抗原与抗体抗原与抗体 抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体， 并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其 它高分子化合物）。 抗原性包括免疫原性和抗原特异性。 免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。 抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。 抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定 （一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基 团称抗原决定簇。 抗原决定簇的作用： 被免疫活性细胞识

14、别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。 与相应抗体的Fab结合。 抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖 蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白， 称免疫球蛋白。 抗体具有两个特点： 高度特异性 多样性 几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时 刻约有10000种抗体存在。 抗原抗体反应抗原抗体反应 抗体是2价的，抗原是多价的。 抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。 抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗体复合物，不可溶。 抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。 图 抗原抗体反应的条件： 抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。 二者各有对应的化学基团

15、，通过作用力使二者结合（离子键、 氢键 等） Key and lock Interaction between antigen and antibody Antibody Antigen Antigen Labeled antigen Antigen Concentration Relative amount of bound analogue in antibody-based immunoassays - the development of the competitive binding assay, using radioisotope and later enzyme- labele

16、d immunoassays 基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法： 酶联免疫吸附测定（ELISA） Western印迹(Western blot) 蛋白质的分离纯化是最艰巨的任务蛋白质的分离纯化是最艰巨的任务 目的目的 提高蛋白质的比活性提高蛋白质的比活性 原理原理 分子量；分子量； 溶解度；溶解度； 电荷；电荷； 吸附性质；吸附性质； 对其它分子的生物亲和力对其它分子的生物亲和力 1 1 抽提抽提 破细胞破细胞 动物组织动物组织 匀浆；反复冻融匀浆；反复冻融 植物植物 研磨研磨 细菌细菌 超声波振荡；研磨；溶菌酶超声波振荡；研磨；溶菌酶 提取提取 pH：选择合适选择合适pH的缓冲液，如的缓

17、冲液，如Tris，磷酸盐，磷酸盐， 醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白 在此在此pH条件下稳定。条件下稳定。 温度：温度：低温如低温如4-10，蛋白酶活性较低。，蛋白酶活性较低。 离子强度：离子强度：如如0.1-0.2 M NaCl或或KCl. 其他成分：其他成分： 还原剂还原剂 NaHSO4，维生素，维生素C 巯基保护剂巯基保护剂 DTT，巯基乙醇，巯基乙醇 金属螯合剂金属螯合剂 EDTA，EGTA 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 PMSF 分离细胞器分离细胞器 如目的蛋白在某一细胞组分内如目的蛋白在某一细胞组分内( (细胞核、染色体、核糖体等细胞核、

18、染色体、核糖体等) ) 除核酸除核酸 酶法酶法DNase,RnaseDNase,Rnase 超声超声 除脂肪除脂肪 丙酮丙酮 脂肪酶脂肪酶 除盐除盐 超滤超滤 凝胶过滤凝胶过滤 冻干冻干 2 2 分离分离 粗分级粗分级 简便，处理量大，浓缩蛋白质溶液简便，处理量大，浓缩蛋白质溶液 等电点沉淀等电点沉淀 盐析盐析 (NH4)2SO4沉淀沉淀 稀释沉淀稀释沉淀 有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀 吸附吸附 超滤超滤 等电点沉淀等电点沉淀 盐析与盐溶盐析与盐溶 Solubility pH pI Solubility Salt concentration Salting in Salting out 3 3 纯

19、化纯化 规模小，分辨率高规模小，分辨率高 凝胶过滤凝胶过滤(分子筛层析、分子排阻层析分子筛层析、分子排阻层析) 利用蛋白质分子量的不同利用蛋白质分子量的不同 Sephadex Bio-Gel Sepharose 凝胶过滤凝胶过滤 大分子量的先出来大分子量的先出来 小分子量的后出来小分子量的后出来 纤维素离子交换层析纤维素离子交换层析 利用蛋白质电荷的性质利用蛋白质电荷的性质 阳离子阳离子: 羧甲基纤维素羧甲基纤维素 (CM-) -O-CH2-COO 阴离子阴离子: 二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素 (DEAE-) -O-CH2-CH2-NH(C2H5)2 - + 纤维素离子交换层析纤维

20、素离子交换层析 亲和层析亲和层析 蛋白质能与特异的配体结合蛋白质能与特异的配体结合 ( (专一、非共价、可逆专一、非共价、可逆) ) 配体常连接在琼脂糖凝胶配体常连接在琼脂糖凝胶(Sepharose)(Sepharose)上上 配体选择：配体选择： 抗原抗原抗体抗体 酶酶抑制剂抑制剂 酶酶底物底物 激素激素受体受体 金属结合蛋白金属结合蛋白螯和剂螯和剂 糖蛋白糖蛋白凝集素凝集素 亲和层析是最好的纯化方法亲和层析是最好的纯化方法 之一之一 电泳法电泳法 电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。 最常用：最常用：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE

21、) 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为 支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰丙烯酰 胺胺和交联剂和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形经过聚合交联从而形 成的三维空间凝胶网络。成的三维空间凝胶网络。 蛋白质电泳迁移率取决于蛋白质的蛋白质电泳迁移率取决于蛋白质的电荷、分子量和形电荷、分子量和形 状状 超离心法超离心法 结晶法结晶法 HPLC(HPLC(高压液相色谱高压液相色谱) ) 4 4 鉴定鉴定 纯度鉴定纯度鉴定 PAGE HPLC 结晶结晶 超离心超离心 N

22、-端测定端测定 分子量测定分子量测定 凝胶过滤凝胶过滤 LgMLgM洗出液体积洗出液体积 作图作图 SDS-PAGESDS-PAGE LgM LgM相对电泳迁移率相对电泳迁移率 作图作图 SDS-PAGE 如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二 烷基硫酸钠（烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要），则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在15， 000200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数之间时，样品的迁移率与其分子量的对数 呈线性关系，符合如下方程式：呈线性关系，符合如下方程式： lg MW = b m R + K 其