第11章,色谱分析法,修改

1、 碳酸钙碳酸钙 石油醚石油醚 植物植物 色素色素 色谱分析色谱分析基于物质的物理性质进基于物质的物理性质进 行分离和分析的方法。行分离和分析的方法。 色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法，其特点为存在两相方法，其特点为存在两相 将色谱法用于分析中，称为色谱分析将色谱法用于分析中，称为色谱分析 碳酸钙碳酸钙 石油醚石油醚 碳酸钙碳酸钙 石油醚石油醚 气固色谱气固色谱(GSC) 气液色谱气液色谱(GLC) 按固定相状态分为按固定相状态分为 流动相流动相 进样进样 装置装置 色谱柱色谱柱 检测器检测器 数据记录数据记录 与处理与处理 min 05101520253035 mAU 0 20 40 60

2、 80 100 DAD1 C, Sig=270,16 Ref=360,100 (HUPINGDSLS-A21.D) 样品样品 色谱峰色谱峰 峰高峰高 基线基线 峰宽峰宽 半峰宽半峰宽 峰面积峰面积 标准偏差标准偏差 E E t 正态分布正态分布 定性、定量定性、定量 分离效果显分离效果显 示示 进进 样样 空空 气气 峰峰 tR tRtM 进进 样样 空空 气气 峰峰 tR tRtM 22 11 RR 21 RR tV r= tV 2ln22 窄窄 分离效果分离效果 一般一般 窄窄 峰间距大峰间距大 （ t大）大） 峰窄峰窄 （操作条件操作条件） 色谱分离的效果：色谱分离的效果： 两组分峰间距

3、足够远两组分峰间距足够远 每个组分峰宽足够小每个组分峰宽足够小 窄窄 上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用上式既反映峰间距也反映峰宽的情况，利用 此式，可直接从色谱流出曲线上求出此式，可直接从色谱流出曲线上求出R。 定义：定义：相邻两组分色谱峰保留值之差与两个相邻两组分色谱峰保留值之差与两个 组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。 (2)(1) (1)(2) 2(-) () RR tt WW R = R=1.5 通常用作是否分开的通常用作是否分开的 判据判据 要改善物质对的分离（提高要改善物质对的分离（提高R），即），即 提高两相邻物质的分离度，增大提高两相邻物

4、质的分离度，增大r21 是是最有最有 效效的手段。的手段。 在气相色谱中，在气相色谱中，增大增大r21最有效的手段是最有效的手段是 改变固定相，改变固定相，选择合适的固定相种类是解决选择合适的固定相种类是解决 分离问题的关键。分离问题的关键。 在高效液相色谱中，流动相的种类和配在高效液相色谱中，流动相的种类和配 比是改善分离最简便有效的方法。比是改善分离最简便有效的方法。 改变柱温也可改变改变柱温也可改变r21。 各物质在一定的色谱条件下均有确定各物质在一定的色谱条件下均有确定 不变的保留值，故可作为定性指标。不变的保留值，故可作为定性指标。 利用纯物质对照定性利用纯物质对照定性 利用文献值对

5、照定性（很少用）利用文献值对照定性（很少用） 混合物经色谱分离后，将各组分直接混合物经色谱分离后，将各组分直接 由由接口接口导入其它仪器中进行定性。常用的导入其它仪器中进行定性。常用的 联用方法有：联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC- MS 使用范围：复杂样品的定性。使用范围：复杂样品的定性。 优点：不需要标准物，定性结果可信度优点：不需要标准物，定性结果可信度 高，操作方便。高，操作方便。 缺点：需要特殊仪器或设备。缺点：需要特殊仪器或设备。 测量与计算测量与计算 mi=fi .Ai 在一定色谱条件下，在一定色谱条件下，被测被测 物质的量与峰面积成正比物质的量与峰面积成正比。 iS

6、 Si SS ii S i i Am Am A/m A/m f f f i i i = A m f %100%100% 100% () ii i i ii ii 总 mm c mm A f A f s ss ii i ss ii s i m fA fA m fA fA m m 常常数数 总总总总 s i ss siii i A A %100 mfA mfA %100 m m %C 内标法内标法 %C A A %C s s i i 气路气路色谱柱色谱柱 进样进样 检测器检测器 数据记录数据记录 与处理与处理 5.记录系统记录系统: 将电信号放大将电信号放大,记录出色谱图记录出色谱图,经数据处理经

7、数据处理 得出结果，现用色谱工作站得出结果，现用色谱工作站 气路气路色谱柱色谱柱 进样进样 检测器检测器 数据记录数据记录 与处理与处理 气相色谱分离过程是在色气相色谱分离过程是在色 谱柱内完成的。谱柱内完成的。 固定相固定相固体吸附剂固体吸附剂担体和固定液担体和固定液 吸附与脱附吸附与脱附溶解与挥发溶解与挥发 组组分分在在流流动动相相中中的的浓浓度度 组组分分在在固固定定相相中中的的浓浓度度 )mL.g(c )mL.g(c K 1 l 1 s K小小 Cl 随载气移动快，随载气移动快，tR 小，小，先出峰先出峰 不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不不同组分能够分离的先决条件是其分配系数不

8、 等。两组分分配系数相差等。两组分分配系数相差越大越大，两峰分离的就，两峰分离的就 越好越好。 固定液类型固定液类型极性极性应用特点应用特点固定液举例固定液举例 烃类烃类最弱最弱非极性化合物非极性化合物角鲨烷角鲨烷 硅油类硅油类极性范围广极性范围广应用范围广应用范围广SE-30、SE-54 聚乙二醇类聚乙二醇类强极性强极性强极性化合物强极性化合物PEG-20M 酯类酯类中强极性中强极性价廉价廉苯二甲酸二壬苯二甲酸二壬 酯酯 腈类腈类强极性强极性极性化合物极性化合物一氧二丙腈一氧二丙腈 特殊固定液特殊固定液分离异构体分离异构体有机皂土有机皂土 (2) 固定液分类及其应用固定液分类及其应用 以非极

9、性角鲨烷的以非极性角鲨烷的P=0 强极性强极性一氧二丙腈一氧二丙腈P=100 为基准，分五级。为基准，分五级。 各组分在其的溶解能力。各组分在其的溶解能力。 参比池测量池 (A)双臂热导池(B)四臂热导池 热导池结构示意图 热丝热丝 (3) 检测原理 基于不同的物质具有不同的热导系数 (4) 操作条件的选择 (3) 原理 蒸气分子受激发后被离子化，在电场作 用下定向运动形成离子流，然后进行放 大和记录。 (4) 操作条件的选择 气体流量 载气:氢气:空气=1:1:10 气体纯度：要求高 使用温度：大于80 柱温选择的原则：柱温选择的原则： 在使最难分离的组分能尽可能好的分离在使最难分离的组分能

10、尽可能好的分离 前提下，尽可能采取前提下，尽可能采取较低的柱温较低的柱温，以保留时，以保留时 间适宜，峰形间适宜，峰形不拖尾不拖尾为度。柱温为度。柱温不能高于固不能高于固 定液的沸点定液的沸点，否则挥发流失。，否则挥发流失。 tc=45 tc=120 3080120180 1.丙烷丙烷 2.丁烷丁烷 3.戊烷戊烷 4.己烷己烷 5.庚烷庚烷 6.辛烷辛烷 7.溴仿溴仿 8.间氯甲苯间氯甲苯 9.间溴甲苯间溴甲苯 填充柱填充柱13m， 要求要求动作快动作快、时间短时间短。 （1）分离效率高：比填充柱高）分离效率高：比填充柱高10100倍；倍； （2）分析速度快：比填充柱色谱分析速度快；）分析速度

11、快：比填充柱色谱分析速度快； （3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温；）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温； （4）灵敏度高，一般采用死体积小，灵敏度高的）灵敏度高，一般采用死体积小，灵敏度高的 检测器，如检测器，如FID； 1.1.特点特点 (1) 无填料、阻力小，长可达百米，管径无填料、阻力小，长可达百米，管径0.2 mm 。 (2) 柱容量小，允许进样量小。柱容量小，允许进样量小。 (3) 总柱效高，分离复杂混合物的能力大为提高。总柱效高，分离复杂混合物的能力大为提高。 (4) 操作条件严格，要求柱外死体积小。操作条件严格，要求柱外死体积小。 (5) 在仪器结构上增加了尾吹和分流。

12、在仪器结构上增加了尾吹和分流。 一、概述 GCHPLC 应用范围应用范围 能气化、热稳定、能气化、热稳定、 低沸点的物质低沸点的物质 热不稳定、高沸点、热不稳定、高沸点、 离子型的物质离子型的物质 热力学理论热力学理论较成熟较成熟正在发展中正在发展中 分析成本分析成本低低高高 分离能力分离能力与柱的类型有关与柱的类型有关较高较高 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 2. 高效液相色谱法的特点 高压：用高压泵使流动液能迅速通过色谱柱 高效：与单位长度气相柱效能比高十多倍 高灵敏度：最小检测量可达10-9 g，甚至10-11 g 高速：配备高压输液设备，流速达1ml/min。 应用范围广泛：可分析

13、80%有机化合物 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以可用于高沸点的、不能气化的、热不稳定的以 及具有生理活性物质的分析及具有生理活性物质的分析 二. 高效液相色谱仪 高压输液系统高压输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 恒流泵：恒流泵：输出流量保持恒定输出流量保持恒定 恒压泵：恒压泵：输出压力恒定输出压力恒定 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两 种，应用最多的是机械往复泵。

14、种，应用最多的是机械往复泵。 高压输液泵要求：密封性好，输出流量高压输液泵要求：密封性好，输出流量 恒定，压力平稳，可调范围宽，耐腐蚀等。恒定，压力平稳，可调范围宽，耐腐蚀等。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置， 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 进样阀进样阀 色谱柱是液相色谱的色谱柱是液相色谱的心脏部件心脏部件 色谱柱色谱柱 柱管：柱管： 固定相：固定相： 不锈钢、铝、铜等不锈钢、铝、铜等 柱长柱长530cm，内径为，内径为45mm 柱体为直型不锈钢管柱体为直型不锈钢管 4、

15、高效液相色谱法、高效液相色谱法 检检 测测 器器 仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 如紫外、荧光、电化学检测器等如紫外、荧光、电化学检测器等 对试样和洗脱液总的物理或化学性质有对试样和洗脱液总的物理或化学性质有 响应。如示差折光，电导检测器等。响应。如示差折光，电导检测器等。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 1. 紫外检测器 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (1) 原理：原理：朗伯比尔定律。朗伯比尔定律。 固定波长的紫外检测器固定波长的紫外检测器 可变波长的紫外检测器可变波长的紫外检测器 二极管阵列检测器二

16、极管阵列检测器 (3) 紫外检测器分类紫外检测器分类 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (A) 固定波长的紫外检测器 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (B) 可变波长的紫外检测器 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (C) 光电二极管阵列检测器 一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约 1nm谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快谱带宽的单色光，各检测特定波长，计算机快 速处理，三维立体谱图。速处理，三维立体谱图。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 2. 差示折光检测器 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (1) 原理：原理：通过连续检

17、测参比池和样品池中通过连续检测参比池和样品池中 流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度流动相之间的折射率之差值来测定样品浓度 （折射率差值与浓度呈正比）。（折射率差值与浓度呈正比）。 (2) 特点：特点：通用型检测器（物质具有折射率）通用型检测器（物质具有折射率） 灵敏度低、对温度敏感、灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱不能用于梯度洗脱。 (3) 结构：结构：偏转式、反射式和干涉型三种偏转式、反射式和干涉型三种 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (1) 原理：原理：根据物质在某些介质中电离后根据物质在某些介质中电离后 产生电导变化来测定电离物质的含量。

18、产生电导变化来测定电离物质的含量。 (2) 特点：特点：广泛用于离子色谱仪中。应广泛用于离子色谱仪中。应 用于能电离成离子物质的检测。响应受用于能电离成离子物质的检测。响应受 温度影响较大。温度影响较大。 (3) 结构：结构：由一对平行的铂电极（表面镀由一对平行的铂电极（表面镀 铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测铂黑以增加表面积）和池体构成电导检测 池，两电极构成电桥的一个测量臂。池，两电极构成电桥的一个测量臂。 3. 电导检测器 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 三. HPLC主要分离类型及其原理 化学键合相色谱法 液固色谱法 离子交换色谱法 体积排阻色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相

19、色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 C8柱，柱，C18柱柱 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (3) 固定相 固定相应符合下列要求： 颗粒细且均匀； 传质快； 机械强度高，能耐高压； 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 键合固定相类型键合固定相类型 非极性键合相非极性键合相 ： 非极性烃如非极性烃如C18,C8与苯基等键合在硅胶表面与苯基等键合在硅胶表面 用于用于反相反相色谱；色谱； 弱极性键合相：弱

20、极性键合相： 醚基和二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相 用于用于反相或正相反相或正相色谱色谱 极性键合相：极性键合相： 常用氨基常用氨基氰基键合相键合硅胶氰基键合相键合硅胶 一般用于一般用于正相正相色谱色谱 (4) 流动相 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 溶剂的种类 正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲 烷、氯仿等，己烷为主体，加入质子接 受体乙醚或甲基叔丁基醚，质子给予体 氯仿，偶极溶剂二氯甲烷 反相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙 醇及其混合物等，以水为主体，加入质 子接受体甲醇，质子给予体乙腈，偶剂 溶剂四氢呋喃。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法

21、正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱 固定相固定相极性极性非极性非极性 流动相流动相非极性非极性极性极性 溶质分子与固定相溶质分子与固定相 作用力作用力 极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、 氢键）氢键）“强烈强烈” 色散力（非选择性）色散力（非选择性） “微弱微弱” 溶质分子与流动相溶质分子与流动相 作用力作用力 色散力（非选择性）色散力（非选择性）极性作用力（偶极、极性作用力（偶极、 氢键）氢键） 极性溶质极性溶质保留时间随极性增保留时间随极性增 大而增大大而增大 小或难保留小或难保留 非极性溶质非极性溶质小或难保留小或难保留可保留，保留时间可保留，保留时间 随极性减少而增大随极性减少而增大

22、4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 2. 液固色谱法 (1) 分离原理 以固体吸附剂为固定相、液体为流动相 的液相色谱法。 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 l硅胶为固定相时：以弱极性的正构烷烃为主 体，加入二氯甲烷等中等极性溶剂调节合适 的洗脱强度。 l可用水对硅胶进行减活处理，或加入四氢呋 喃、乙腈、甲醇、异丙醇等改性剂 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 (4) 应用 中等分子量的油溶性样品如油品、脂 肪、芳烃等 不同极性取代基的化合物 结构异构体和几何异构体混合物的分 离 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 3. 离子交换色谱法和离子色谱法 4、高效液相色谱法、高效液相色谱法 （2）固定相 离子交换树脂，根据功能基分为 强酸型（磺酸基团） 强碱型（季铵基） 弱酸型（羧酸） 弱碱型（伯、仲