研究生高级生化技术PPT学习教案

1、会计学1 研究生高级生化技术研究生高级生化技术 一、实验操作及注意事一、实验操作及注意事 项项 第1页/共36页 933min 预变性预变性 (Hema PCR仪的使用与程序设计仪的使用与程序设计) 9345s，5535s，7260s 重复重复25个循环个循环 72保温保温5min，-20保存备用保存备用 第2页/共36页 第3页/共36页 Kary MullisKary Mullis l PCRPCR技术最早由美国技术最早由美国 CetusCetus公公 司人类遗传研究室司人类遗传研究室Kary MullisKary Mullis及及 同事于同事于19851985年发现并研制成功的年发现并研

2、制成功的 。 lKary MullisKary Mullis因发明了因发明了“聚合酶链聚合酶链 式反应式反应”而获得而获得19931993年度诺贝尔年度诺贝尔 化学奖。化学奖。 第4页/共36页 第5页/共36页 第6页/共36页 第7页/共36页 第8页/共36页 第9页/共36页 第10页/共36页 第11页/共36页 第12页/共36页 第13页/共36页 第14页/共36页 第15页/共36页 第16页/共36页 第17页/共36页 分光光度技术是利用物质特有分光光度技术是利用物质特有 的吸收光谱对其进行定性、定量分的吸收光谱对其进行定性、定量分 析的实验技术。析的实验技术。 一、分光

3、光度技术一、分光光度技术 第18页/共36页 远紫外远紫外近紫外近紫外 可见可见近红外近红外中红外中红外 远红外远红外 （真空紫外）（真空紫外） 10nm200n m 200nm 380nm 380nm 780nm 780 nm 2.5 m 2.5 m 50 m 50 m 300 m 第19页/共36页 电磁波谱电磁波谱 氢灯氢灯 复合光复合光 (阳光及钨灯阳光及钨灯) 发射光谱发射光谱 红红 橙橙 黄黄 绿绿 青青 蓝蓝 紫紫 单色光单色光 三棱镜三棱镜 可见光分光光度计光源可见光分光光度计光源 紫外分光光度计光源紫外分光光度计光源 高高 低低 第20页/共36页 二、有关光学原理二、有关光

4、学原理 1. 吸收光谱吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液 ， 光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收 而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该 溶液的溶液的吸收光谱吸收光谱。 第21页/共36页 第22页/共36页 A=lg(I0/It)=kb c It I0 b dx I I-dI s 朗伯定律朗伯定律(1760)(1760) A=lg(I0/It)=k1b 比尔定律比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 吸光度吸光度 介质厚度介质厚度(cm) 第23页/共36页 La

5、mbert-Beer定律定律 DK C L 吸光度吸光度 摩尔消光系数摩尔消光系数 吸收物质的光径（吸收物质的光径（cm ） 溶液浓度（溶液浓度（mol/L） 第24页/共36页 722722型分光光度计结构方框型分光光度计结构方框 图图 光源光源 吸收池吸收池 检测系统检测系统 分光系统分光系统 第25页/共36页 利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。 （一）（一） 标准曲线法标准曲线法 （二）（二） 标准管法标准管法 三三. .分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用 第26页/共36页 （一）（一） 标准曲线法标准曲线法 配置浓

6、度递增的标准溶液（配置浓度递增的标准溶液（C），在最大吸收），在最大吸收 波长（波长（ max）处测得各个吸光度（）处测得各个吸光度（A），绘制标准），绘制标准 曲线（曲线（A-C曲线）。曲线）。 在测定被测样品时，以相同条件在在测定被测样品时，以相同条件在 max处测处测 定定A值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。值，从标准曲线上查得该样品相应的浓度。 分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用 第27页/共36页 0 1 2 3 4 mg/ml A 。 。 。 。 * 0.8 0.6 0.4 0.2 0 溶液浓度的测定溶液浓度的测定 A bc 工作曲线法工作曲线法 (校准曲

7、线校准曲线) 朗伯朗伯-比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用 第28页/共36页 （二）（二） 标准管法标准管法 在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（C标 标）标准溶液的吸光度 ）标准溶液的吸光度 （A标 标），同时测定未知浓度（ ），同时测定未知浓度（C样 样）样品溶液的吸光度 ）样品溶液的吸光度 （A样 样），根据 ），根据Lambert-Beer定律：定律： A标 标=K标标C标标L标标 A样 样=K样样C样样L样样 分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用 第29页/共36页 样品与标准物质成分相同样品与标准物质成分相同 K标 标= K样样 比色皿规格相

8、同比色皿规格相同 L标 标=L样样 /： A标 标/ A样样=C标标/C样样 C样 样= (A样样/A标标)C标标 三三. .分光光度法在生物化学中的应用分光光度法在生物化学中的应用 第30页/共36页 紫外吸收法紫外吸收法 原理：共轭双键原理：共轭双键 优点：优点：简单、快速、灵敏、简单、快速、灵敏、 样品可以回收样品可以回收 缺点：缺点：有一定的误差（原因）；有一定的误差（原因）； 受核酸类物质干扰受核酸类物质干扰 第31页/共36页 结果分析：结果分析： 浓度分析：浓度分析： 光径光径1cm1cm，以溶解蛋白的缓冲液为对照，以溶解蛋白的缓冲液为对照 A A280 280=1.0 =1.0

9、对应蛋白质的浓度为对应蛋白质的浓度为1.0mg/ml 1.0mg/ml 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mlmg/ml） =1.45A=1.45A280 280-0.74A -0.74A260 260 第32页/共36页 用分光光度计法定量用分光光度计法定量DNA 1. 取取2 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入98 l蒸馏水对蒸馏水对 待测待测DNA样品做样品做1:50(或更高倍数的稀释或更高倍数的稀释); 2. 蒸馏水作为空白蒸馏水作为空白,在波长在波长260nm、280nm 处调节紫外分光光度计读数至零。处调节紫外分光光度计读数至零。 第33页/共36页 3.加入加入DNA稀释液，测定稀释液，测定260nm 及及280nm的吸收的吸收 值。值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，读数用于计算样品中核酸的浓度， OD260值为值为1相当于约相当于约50 g /ml双链双链DNA，33 g /ml单链。可根据在单链。可根据在260nm以及在以及在280nm的读数的读数 的比值（的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般）估计核酸的纯度。一般 DNA的纯品，其比值为的纯品，其比值为1.8，低于此