真菌的DNA和RNA提取方法

1、真菌的DNA和RNA提取方法核心提示：一、真菌DNA的提取(方法一)1.实验试剂(1)DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5),0.5MNaCl,0.01MEDTA,1SDS(2)3MNaAc(3)TE:10mmol一、真菌DNA的提取(方法一)1.实验试剂(1)DNA提取液:0.2MTris-HCl(pH7.5),0.5MNaCl,0.01MEDTA,1SDS(2)3MNaAc(3)TE:10mmol/LTris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)(5)氯仿:异戊醇(24:1)(6)异丙醇(7)无水乙醇(8)75%乙醇(

2、9)RNaseA2.实验步骤(1)取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋35min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)(4)1000rpm,4,5min(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4离心5min)(6)取上清,加入2/3倍体积的-20预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ulTE中(8)加入1ulRNaseA(10mg/mL),37处理1h(9

3、)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4离心5min)(10)取上清,1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70沉淀30min以上(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ulTE中,-20保存备用二、真菌DNA的提取(方法二)1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉2.加入3mL65预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65水浴30min,期间混匀2-3次3.加入1mL5MKAc,冰浴20min4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4离心5min)5.取上清,加入2/3倍体积的-2

4、0预冷异丙醇,混匀,静置约30min6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ulTE中7.加入1ulRNaseA(10mg/mL),37处理1h8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4离心5min)9.取上清,1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70沉淀30min以上10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ulTE中,-20保存备用DNA提取缓冲液:100mMTris-HCl(pH8.0),20mMEDTA(pH8.0),1.5MNaCl,2%CTA

5、B(W/V),4%PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5MKAc方法一和二,是大同小异.主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样！三、真菌菌丝的总RNA的提取1.实验试剂(1)RNA提取缓冲液(CTAB):2%CTAB(W/V),2%聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mMTris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mMEDTA,0.5g/L亚精胺Spermidine,2.0MNaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可(2)

6、SSTE:1MNaCl,0.5%SDS(W/V),10mMTris-HClpH8.0,1.0mMEDTA(3)10MLiCl直接用蒸馏水配10MLiCl,加1的DEPC过夜后,高温灭菌(4)3MNaAc(5)氯仿:异戊醇(24:1)(6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)(7)DEPC处理水用1的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌(8)无水乙醇;70%酒精2.实验步骤(1)实验开始前将RNA提取液于65水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中

7、迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀(3)65水浴3-10min,期间混匀2-3次(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4,5min)(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4,5min)(6)加入1/4V体积10MLiCl溶液,4放置6h以上(或过夜)(7)10,000rpm,4离心20min(8)弃上清,用500ulSSTE溶解沉淀(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4,5min)(10)加2V体积的无水乙醇,在-70冰箱沉淀30min以上(11)12,000rpm,4离心20min(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥(13)加200ul的DE