神经培养技术

1、简简 介介 体外培养（体外培养（in vitro culturein vitro culture）包括：）包括： 组织培养（组织培养（tissue culturetissue culture） 细胞培养（细胞培养（cell culturecell culture） 器官培养（器官培养（organ cultureorgan culture） 就是将活体结构成分（如活体组织、细就是将活体结构成分（如活体组织、细 胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出，胞或者器官等）从体内或其寄生体内取出， 放在类似于体内生存环境的体外环境中，让放在类似于体内生存环境的体外环境中，让 其生长和发育的方法。其生长和发育

2、的方法。 萌芽：萌芽：18851885年德国学者年德国学者RouxRoux将鸡胚的神经将鸡胚的神经 板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内 存活数天。存活数天。 起步：起步：19071907年，年，HarrisonHarrison首次成功地用蛙首次成功地用蛙 淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神淋巴液培养了蛙胚神经组织，并观察到神 经细胞突起的生长过程。经细胞突起的生长过程。 神经培养的发展历史神经培养的发展历史 发展：在设备、条件和方法上不断改进，发展：在设备、条件和方法上不断改进， 尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发尤其是自二战结束后，进入了新的飞速发

3、展的阶段。展的阶段。 人类神经系统被公认为是自然界最复杂的人类神经系统被公认为是自然界最复杂的 系统。神经科学（系统。神经科学（neuroscienceneuroscience）已成为当）已成为当 今人类医学和生命科学的前沿。今人类医学和生命科学的前沿。 多个学科、多个研究领域所进行的研究，多个学科、多个研究领域所进行的研究， 均能以神经培养作为研究手段之一。均能以神经培养作为研究手段之一。 神经培养与神经科学神经培养与神经科学 一、按培养物的整体性及大小分类一、按培养物的整体性及大小分类 细胞分散培养细胞分散培养 （dissociated culturedissociated culture

4、） 器官器官- -组织型培养组织型培养 （器官型培养）（器官型培养） （organotypical cultureorganotypical culture） 神经培养的分类神经培养的分类 可直接按培养的对象命名：如小可直接按培养的对象命名：如小 脑培养，神经节培养，星形胶质细胞脑培养，神经节培养，星形胶质细胞 培养，少突胶质细胞培养，雪旺细胞培养，少突胶质细胞培养，雪旺细胞 培养等。培养等。 二、按培养的对象分类二、按培养的对象分类 静置培养：载片式、试管式、培养瓶式等。静置培养：载片式、试管式、培养瓶式等。 旋转管培养：不断缓慢转动，以便经常更动旋转管培养：不断缓慢转动，以便经常更动 培养

5、液与培养物的关系。培养液与培养物的关系。 三、按培养的方式分类三、按培养的方式分类 原代培养（原代培养（primary cultureprimary culture）：神经细胞一）：神经细胞一 般不再分裂，不传代，故属原代培养。般不再分裂，不传代，故属原代培养。 再培养（再培养（sub-culturesub-culture）：把培养物切、割、）：把培养物切、割、 取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。取、弃等修改后，换培养液后再继续培养。 联合培养（联合培养（coculturecoculture）：把两种或两种以上）：把两种或两种以上 的组织放在一起进行培养。的组织放在一起进行培养。 四、其它

6、四、其它 按开创研究者的名字命名，如按开创研究者的名字命名，如MaximowMaximow 双盖片法。双盖片法。 在培养液中专门加入某种激素、神经生在培养液中专门加入某种激素、神经生 长因子或某些药物而标以某某特殊培养。长因子或某些药物而标以某某特殊培养。 五、以上方式的综合或特殊设计的培养五、以上方式的综合或特殊设计的培养 综合上述数种方式的培养或培养与移植综合上述数种方式的培养或培养与移植 相结合的特殊设计的培养等。相结合的特殊设计的培养等。 一、一、 无污染环境无污染环境 二、二、 温度温度 3737 三、三、 气体环境和氢离子浓度气体环境和氢离子浓度 95%95%空气和空气和5%5%二

7、氧化碳二氧化碳 pHpH值为值为7.27.47.27.4 神经培养所需的环境条件神经培养所需的环境条件 1. 1.葡萄糖：较高。葡萄糖：较高。 2.2.氨基酸氨基酸 3.3.维生素维生素 4.4.促生长因子促生长因子 神经生长因子（神经生长因子（NGFNGF） 5.5.其它其它 四、四、 基本营养物质基本营养物质五、渗透压五、渗透压 260320 mOsm/kg260320 mOsm/kg 半固体培养基半固体培养基 液体培养基液体培养基 天然培养基（天然培养基（natural mediumnatural medium） 合成培养基（合成培养基（synthetic mediumsynthetic

8、 medium） 无血清培养基（无血清培养基（serum free mediumserum free medium） 六、培养基六、培养基 玻璃玻璃多聚赖氨酸多聚赖氨酸覆着底物覆着底物 一次性塑料一次性塑料细胞外基质成分细胞外基质成分 细胞粘附分子细胞粘附分子 单层非神经元细胞单层非神经元细胞 七、培养器皿和附着底物七、培养器皿和附着底物 神经培养的基本实验设备神经培养的基本实验设备 一般包括：一般包括： 准备室准备室 无菌操作室无菌操作室 缓冲间缓冲间 进行其它操作的实验间进行其它操作的实验间 一、神经培养室的建立一、神经培养室的建立 二、实验室设备二、实验室设备 超净工作台（超净工作台（s

9、uper clean benchsuper clean bench，hoodhood）、）、 COCO2 2培养箱、电热干燥箱、高压蒸气消毒培养箱、电热干燥箱、高压蒸气消毒 器、冰箱、倒置相差显微镜、解剖体视显器、冰箱、倒置相差显微镜、解剖体视显 微镜、自动纯水蒸馏器、洗刷装置、抽滤微镜、自动纯水蒸馏器、洗刷装置、抽滤 装置、离心机、微波炉等装置、离心机、微波炉等 三、器械三、器械 四、培养器皿四、培养器皿 1. 1. 玻璃器皿玻璃器皿 2. 2. 塑料器皿塑料器皿 培养用液培养用液 平衡盐溶液（平衡盐溶液（Balanced Salt Solution, BSSBalanced Salt So

10、lution, BSS） 天然培养基（天然培养基（Natural MediumNatural Medium） 合成培养基（合成培养基（Synthetic MediumSynthetic Medium） 其它其它 一、水和平衡盐溶液一、水和平衡盐溶液 1. 1. 水：是细胞赖以生存的主要环境。水：是细胞赖以生存的主要环境。 2. 2. 平衡盐溶液：是从平衡盐溶液：是从RingerRinger生理盐水发展生理盐水发展 起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。 PBSPBS、HanksHanks、D-HanksD-Hanks、TyrodeTyrode、 DulbeccoD

11、ulbecco、EarleEarle、EagleEagle 几种常用平衡盐溶液的组成成分（几种常用平衡盐溶液的组成成分（g/Lg/L） RingerRingerPBS PBS TyrodeTyrodeEarleEarleHanksHanksDulbeccoDulbeccoD-HanksD-HanksEagleEagle CaClCaCl2 20.250.250.20.20.20.20.140.14 KClKCl0.420.420.20.20.20.20.040.040.40.40.20.20.40.40.40.4 KHKH2 2POPO4 40.20.20.060.060.20.20.060.

12、06 MgClMgCl6H6H2 2OO0.10.10.10.1 MgSOMgSO4 47H7H2 2OO0.20.20.10.10.20.2 NaClNaCl9.09.08.08.08.08.06.686.688.08.08.08.08.08.06.86.8 NaHCONaHCO3 31.01.02.22.20.350.350.350.352.22.2 NaHPONaHPO4 47H7H2 2OO1.561.560.090.092.162.160.060.06 NaHNaH2 2POPO4 4H2OH2O0.050.050.140.141.41.4 葡萄糖葡萄糖1.01.01.01.01.0

13、1.01.41.4 酚红酚红 0.020.020.010.010.020.020.010.01 1. 1. 血清血清 牛血清牛血清 成年牛血清成年牛血清 新生牛血清新生牛血清 胎牛血清胎牛血清 马血清马血清 羊血清羊血清 二、天然培养基二、天然培养基 2. 2. 胚胎浸出液：胚胎浸出液： 鸡胚浸出液、牛胚浸出液鸡胚浸出液、牛胚浸出液 内含有生长因子、大分子核蛋白和小分内含有生长因子、大分子核蛋白和小分 子氨基酸等，有促进细胞生长的作用。子氨基酸等，有促进细胞生长的作用。 液体培养基、粉制培养基液体培养基、粉制培养基 BEMBEM：Basal Eagle Medium Basal Eagle M

14、edium 基础基础EagleEagle培养基培养基 MEMMEM：Minimum Eagle Medium Minimum Eagle Medium 低限量低限量 EagleEagle培养基培养基 DMEMDMEM：DulbeccoDulbeccos Modified Eagle Medium s Modified Eagle Medium Dulbecco Dulbecco改良改良EagleEagle培养基培养基 IMEMIMEM：Iscove Modified Eagle Medium Iscove Modified Eagle Medium Iscove Iscove改良改良Eagle

15、Eagle培养基培养基 三、合成培养基三、合成培养基 四、无血清培养基四、无血清培养基 以合成培养基配成基础培养液，再补加其以合成培养基配成基础培养液，再补加其 它成分。它成分。 1. 1. 基础培养液基础培养液 Ham F12Ham F12和和DMEMDMEM混合培养液混合培养液 DMEM/F12(1:1)DMEM/F12(1:1) 神经元基础培养基（神经元基础培养基（neurobasal mediumneurobasal medium） 2. 2. 生长附加成分生长附加成分 比较通用的：比较通用的： 胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺 （丁二胺）（丁二

16、胺） B-27B-27、N-2N-2（GibcoGibco） 全培液全培液 以下各种成分各以下各种成分各10 ml10 ml配制成全配配制成全配 液液40 ml40 ml（葡萄糖含量为（葡萄糖含量为6g/L6g/L）：）： 1. 1.胎牛血清胎牛血清 2.2.DMEMDMEM 3.3.九天鸡胚渗出液九天鸡胚渗出液 4.4.Glucose/BSSGlucose/BSS（5%5%葡萄糖溶液葡萄糖溶液 4.7 ml4.7 ml， TyrodeTyrodes BSS 5.3 mls BSS 5.3 ml） 其它常用溶液其它常用溶液 1. 1. 消化液消化液 胰蛋白酶溶液（胰蛋白酶溶液（trypsin

17、solutiontrypsin solution） 适于消化细胞间质（主要是纤维）较少的软适于消化细胞间质（主要是纤维）较少的软 组织。组织。 需用不含需用不含CaCa2+ 2+和 和MgMg2+ 2+的平衡盐溶液配制。 的平衡盐溶液配制。 用血清或含血清的培养液以终止消化作用。用血清或含血清的培养液以终止消化作用。 0.25% 0.25%、0.125%0.125%、0.08% 0.08% 胶原酶溶液胶原酶溶液 （collagenase solutioncollagenase solution） 对胶原有强的消化作用，适于消化成年对胶原有强的消化作用，适于消化成年 的背根神经节等纤维较多的组织

18、。此酶的背根神经节等纤维较多的组织。此酶 作用缓和，且无须机械震荡。作用缓和，且无须机械震荡。 Ca Ca2+ 2+、 、 MgMg2+ 2+和血清存在下仍有活性。 和血清存在下仍有活性。 EDTAEDTA溶液溶液 EDTA EDTA（二乙胺四乙酸二钠）是一种化学（二乙胺四乙酸二钠）是一种化学 螯合剂，对细胞有一定的离解作用，毒螯合剂，对细胞有一定的离解作用，毒 性小，价格低廉，使用方便。性小，价格低廉，使用方便。 2. pH2. pH调整液调整液 NaHCONaHCO3 3液液 7.4% 7.4%、5.6%5.6%、3.7%3.7% HEPESHEPES液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）液（羟乙基哌嗪

19、乙硫磺酸） 终浓度终浓度1050 mmol1050 mmol/L 3. 3. 抗生素液抗生素液 青霉素青霉素 100U/ml 100U/ml 链霉素链霉素 100 100g/mlg/ml 4. 4. 谷氨酰胺溶液谷氨酰胺溶液 常配成常配成100100倍（倍（200 mmol/L200 mmol/L） 终浓度终浓度14 mmol/L 14 mmol/L 5. 5. 有丝分裂抑制剂有丝分裂抑制剂 阿糖胞苷（阿糖胞苷（ara-cara-c） 35 35 g/mlg/ml 5-5-氟脱氧尿嘧啶氟脱氧尿嘧啶 神经培养的基本技术程序神经培养的基本技术程序 培养前准备培养前准备 新鲜组织取材新鲜组织取材 培

20、养接种培养接种 标本维持标本维持 观察记录观察记录 培养前准备培养前准备 1. 1. 实验室准备实验室准备 2. 2. 器皿准备器皿准备 3. 3. 液体准备液体准备 4. 4. 动物准备动物准备 取材取材 新鲜、无菌新鲜、无菌 动作轻柔，切忌损伤组织动作轻柔，切忌损伤组织 熟练，操作时间过长会增加污染机会熟练，操作时间过长会增加污染机会 取材时要滴加平衡盐溶液以防干燥取材时要滴加平衡盐溶液以防干燥 培养接种培养接种 包括组织块接种和单细胞悬液接种。包括组织块接种和单细胞悬液接种。 器官器官- -组织型培养组织型培养 组织不能太大，通常以薄片形式，厚组织不能太大，通常以薄片形式，厚 度一般不超

21、过度一般不超过1 mm1 mm。 细胞分散培养细胞分散培养 细胞分散培养是从细胞分散培养是从2020世纪世纪5050年代才年代才 逐渐开展起来的。逐渐开展起来的。 神经细胞分散培养则开始于神经细胞分散培养则开始于19521952年年 由由MosconaMoscona进行的鸡视网膜细胞的分离培进行的鸡视网膜细胞的分离培 养。养。 神经组织的分离神经组织的分离 分散细胞的目的在于使细胞之间的分散细胞的目的在于使细胞之间的 连接解离，制成单细胞悬液。连接解离，制成单细胞悬液。 常用的分散细胞的方法有：机械分散常用的分散细胞的方法有：机械分散 法和消化分离法。法和消化分离法。 标本维持标本维持 37

22、5% CO 5% CO2 2 培养箱 培养箱 更换培养液更换培养液 一般一般2323天天 观察记录观察记录 肉眼或放大镜下观察肉眼或放大镜下观察 倒置相差显微镜观察倒置相差显微镜观察 电子显微镜观察电子显微镜观察 新生大鼠基底神经节神经元的分散培养新生大鼠基底神经节神经元的分散培养 1. 1. 取新生取新生1 1天大鼠天大鼠1 1只，只，7575酒精棉球消毒后取心脏酒精棉球消毒后取心脏 处死。处死。 2.2.剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨。于颅顶骨基剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨。于颅顶骨基 底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织。底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织。 3.3.从后内侧向前外侧

23、用眼科镊小心翻去大脑皮层，从后内侧向前外侧用眼科镊小心翻去大脑皮层， 暴露基底神经节。暴露基底神经节。 4.4.小心夹取基底神经节组织，放入有小心夹取基底神经节组织，放入有1 ml D-Hanks1 ml D-Hanks 液的小烧杯内，眼科剪剪成液的小烧杯内，眼科剪剪成1 mm1 mm3 3组织块。组织块。 5.5. 把组织块移到离心管内，吸除多余的把组织块移到离心管内，吸除多余的D-HanksD-Hanks 液后用液后用0.1250.125胰酶胰酶1 ml 371 ml 37消化消化30 min30 min。时。时 间不定间不定 6.6. 50l50l胎牛血清终止消化，滴管小心吹打，打胎牛血

24、清终止消化，滴管小心吹打，打 散组织。散组织。 7.7. 200200目铜网过滤，离心目铜网过滤，离心1000 r/min5min1000 r/min5min。 8.8. 弃上清，用含弃上清，用含1010胎牛血清胎牛血清DMEM/F12DMEM/F12培养液培养液 重悬悬沉积物，计数板计数，调整细胞密度为重悬悬沉积物，计数板计数，调整细胞密度为 5 510105 5/ml/ml。 9.9. 六孔培养板每孔六孔培养板每孔2 ml2 ml培养液，置于培养液，置于3737饱和饱和 湿度含湿度含5 5COCO2 2空气的培养箱内培养。空气的培养箱内培养。 10.10. 24 h24 h后全量换液，以后每隔后全量换液，以后每隔2 2天全量换液。若天全量换液。若 杂质较多可在杂质较多可在 培养第培养第3 3天加入终浓度为天加入终浓度为 5g/ml5g/ml的阿糖胞苷作用的阿糖胞苷作用24 h24 h后换液。后换液。 可直接按培养的对象命名：如小可直接按培养的对象命名：如小