第八章 人工种子

1、第八章第八章 人工种子人工种子 人工种子（人工种子（artificial seeds),),又称合成种子又称合成种子（synthetic seeds) )或体细胞种子（或体细胞种子（somatic seeds) ) 1978 1978年，年，Murashige在第四届国际植物在第四届国际植物组织细胞培养大会上提出。组织细胞培养大会上提出。 第一节第一节 人工种子概念人工种子概念狭义狭义 的概念是指植物离体培养中产生的胚状的概念是指植物离体培养中产生的胚状体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有体（包括体细胞胚和性细胞胚），包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件养分和具有保护功能的物

2、质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。下能够发芽出苗的颗粒体。广义广义 而言，人工种子是在胚状体或一块组织而言，人工种子是在胚状体或一块组织（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外（顶芽、腋芽）、一个器官（小鳞茎等）之外加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有加上必要的营养成分（人工胚乳）后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体的与天然种子相似的颗粒体人工种子的结构农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、农业生产中使用的天然种子，一般都是由种被、胚乳和胚三部分构成。胚乳和胚三部分构成。 目前研制的人工种子的结构目前

3、研制的人工种子的结构: : 体细胞胚、人工种皮、人工胚乳体细胞胚、人工种皮、人工胚乳 人工种子制作要求（狭义）人工种子制作要求（狭义） 人工种子制作要求：要求能够同步地、大人工种子制作要求：要求能够同步地、大规模地产生规模地产生成熟的体细胞胚状体成熟的体细胞胚状体；给胚状体包；给胚状体包裹上裹上高质量的人工种皮高质量的人工种皮；最后解决人工种子的；最后解决人工种子的保存和运输问题。保存和运输问题。控制胚状体的同步发育控制胚状体的同步发育控制胚状体同步发育的方法：控制胚状体同步发育的方法：1、用、用 DNA抑制剂处理细胞培养物抑制剂处理细胞培养物 5-氨基尿嘧啶；低温处理抑制细胞分裂，再把温度提

4、氨基尿嘧啶；低温处理抑制细胞分裂，再把温度提高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。高到正常的培养温度，也可达到部分同步化。2、分离过筛、分离过筛 可获得大小均一的胚性细胞团，再转移到无激素培养基可获得大小均一的胚性细胞团，再转移到无激素培养基上培养，可得到大小基本一致的胚状体。上培养，可得到大小基本一致的胚状体。3、利用气体调控胚状体的同步发生、利用气体调控胚状体的同步发生间歇性地向悬浮培养物中通间歇性地向悬浮培养物中通氮气或乙烯氮气或乙烯可达到胚状体发可达到胚状体发生的同步化。生的同步化。4、利用渗透压调控胚状体的同步生长、利用渗透压调控胚状体的同步生长胚状体由小到大，其渗透压由高到低。可

5、用高浓度的蔗胚状体由小到大，其渗透压由高到低。可用高浓度的蔗糖培养基来控制胚的发育，使其停留于某一阶段，然糖培养基来控制胚的发育，使其停留于某一阶段，然后降低蔗糖浓度，使胚状体进入同步发育的状态。后降低蔗糖浓度，使胚状体进入同步发育的状态。胚状体的包埋与人工种子的制作胚状体的包埋与人工种子的制作人工种皮要满足的要求：人工种皮要满足的要求：包埋剂应当对胚状体包埋剂应当对胚状体无害，成本低廉；无害，成本低廉；要有一定硬度，能保护胚要有一定硬度，能保护胚状体不受损害；状体不受损害；应当含有生长激素和防腐剂，应当含有生长激素和防腐剂，有利于胚状体的萌发。有利于胚状体的萌发。好的包埋剂：既能包住体细胞胚

6、，又能保证胚的好的包埋剂：既能包住体细胞胚，又能保证胚的存活和正常萌发存活和正常萌发褐藻酸盐、琼脂、白明胶、角叉菜胶和槐豆胶褐藻酸盐、琼脂、白明胶、角叉菜胶和槐豆胶最好是最好是褐藻酸盐褐藻酸盐包埋过程包埋过程 胚状体和胚状体和2藻酸钠混合，吸管吸入，滴到藻酸钠混合，吸管吸入，滴到2.5%氯化钙水溶液中，两种离子交换，在胚状体氯化钙水溶液中，两种离子交换，在胚状体外面产生褐藻酸钙的胶囊，形成人工种皮。外面产生褐藻酸钙的胶囊，形成人工种皮。 胶囊大小，人工种皮厚度都可以控制。胶囊大小，人工种皮厚度都可以控制。 人工胚乳：营养物质、植物激素和抗菌物质。人工胚乳：营养物质、植物激素和抗菌物质。人工种皮

7、 胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。包裹成功的人工种子既能通气、保持水分和营养，又能防止外部一定的机械冲击力。人工胚乳 人工胚乳一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成,养分包括矿质元素、维生素、碳源以及激素等。第二节 繁殖体的类型及生产根据根据RedenbaughRedenbaugh对人工种子的分类方法，可将人工种对人工种子的分类方法，可将人工种子分为三大类：子分为三大类： 裸露的或休眠的繁殖体裸露的或休眠的繁殖体 如微鳞茎，微块茎等。如微鳞茎，微块茎等。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。它们在不加包被的情况下也具有较高的成株率。 人工种皮包被的繁殖体人工种

8、皮包被的繁殖体 一些体细胞胚、原球一些体细胞胚、原球茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可茎等不能过度干燥，但只需要用人工种皮包被即可维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。维持良好的发芽状态，如胡萝卜体细胞胚。 水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体 大多数大多数体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态体细胞胚、不定芽、茎尖等均需要先包埋在半液态凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维凝胶中，再经人工种皮包裹才能避免失水，从而维持良好的发芽能力。持良好的发芽能力。 生产人工种子的意义其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法，它既 能保持原

9、有品种的种性，又可以使之具有实生苗的复壮效应；其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有主要的适用意义；其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用；其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产，同时还避免了种子携带病原菌的危险；其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。 人工种子的局限性 目前，绝大多数人工种子发芽需要无菌条件，所以，还不能实现广泛应用。另外，人工种子的制作费用过高，并且在应用上需要各

10、个环节的配套，这些都限制了人工种子的推广。表7.1 以体细胞胚为繁殖体的人工种子 物 种主 要 结 果胡萝卜(Daucus carota)有菌土壤中发芽成苗苜蓿(Medicago sativas)有菌条件下发芽成苗芹菜(Apium graveolens)有菌条件下发芽成苗柑橘(C. sinensisC. reticulata)无菌条件下发芽成苗挪威云杉(Picea abies)无菌及有菌条件下发芽松树(Pinus lambertiana, P. aeda)无菌及有菌条件下发芽玉米(Zea mays)无菌条件下发芽成苗杂交水稻(O. sativaO. lalifolia)无菌条件下发芽橡胶树(H

11、evea brasiliensis)无菌条件下发芽西洋参(Panax quinquefolium)无菌条件下发芽刺五加(Acanthopanax senticosus)无菌及有菌条件下成苗黄连(Coptis chinensis)无菌及有菌条件下成苗表7.2 以器官为繁殖体的人工种子 物 种繁殖体主 要 结 果印度桑(Morus indica)芽无菌条件下发芽成苗檀香(Santalum ablum)芽无菌条件下发芽成苗花叶芋(Caladium bicolor)芽无菌条件下发芽成苗百合(Lilium)小鳞茎无菌条件下发芽成苗直杆桉树(Eucalyptus maideni)侧芽无菌条件下发芽成苗莴苣

12、(Lacyuca sativa)芽无菌及有菌条件下发芽成苗华腺萼木(Mycetia sienensis)微芽有菌土壤中发芽成苗大花蕙兰(Cytobium)原球茎无菌条件下发芽石槲兰(Dendrobium)原球茎无菌条件下发芽唐菖蒲(Gladiolus hortalans)球茎无菌条件下发芽香蕉(Musa acuminata)微芽无菌条件下发芽杨树(Populus beijingy)芽无菌条件下发芽人工种子的基本制作流程（体细胞胚）人工种子的基本制作流程（体细胞胚）1 1、外植体的选择和消毒、外植体的选择和消毒2 2、愈伤组织的诱导、愈伤组织的诱导3 3、体细胞胚的诱导、体细胞胚的诱导4 4、体

13、细胞胚的同步化、体细胞胚的同步化5 5、体细胞胚的分选、体细胞胚的分选6 6、体细胞胚的包裹、体细胞胚的包裹( (人工胚乳人工胚乳) )7 7、包裹外膜、包裹外膜8 8、发芽成苗试验、发芽成苗试验9 9、体细胞胚变异程度与农艺研究、体细胞胚变异程度与农艺研究人工种子繁殖体的处理体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后体细胞胚形成后，需要在无激素培养基上经过一定阶段的后熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包熟培养，然后进行脱水干燥，再将畸形胚选出后才能进行包埋。在脱水之前用埋。在脱水之前用ABAABA处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利处理体细胞胚强迫其进入休眠，更有利于

14、长期贮存。于长期贮存。微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除微型变态器官繁殖体不能过度脱水，但亦需要适当干燥，除去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被去表面及多余的水分，同时要进行表面消毒处理以防止包被后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当后的感染。为了延长贮存时间，亦需根据使用季节进行适当的休眠处理。的休眠处理。芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长芽为繁殖体的类型，则不能进行脱水处理，但必需筛选生长健壮、组织充实的芽进行包埋。健壮、组织充实的芽进行包埋。 第三节 人工种子包被 繁殖体包埋介质的要求首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，

15、并具有一首先必需是对繁殖体及其它生物是无毒的，并具有一定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操定的缓冲强度，以保证繁殖体在生产、运输和种植操作中的安全。作中的安全。同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供同时，它最好能够提供类似于胚乳的营养物质，以供繁殖体发芽的需要。繁殖体发芽的需要。此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生此外由于繁殖体的含水量较高，贮存中极易受到微生物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。物感染危害，因此介质中还应含有适当的杀菌剂。 人工胚乳常用配方MS（或SH、White）培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物；SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖

16、。常用包埋方法 主要有液胶包埋法、干燥包埋法主要有液胶包埋法、干燥包埋法 和水凝胶法和水凝胶法 等。等。液胶包埋法是将胚状体或小植株悬浮在一种黏滞流体液胶包埋法是将胚状体或小植株悬浮在一种黏滞流体胶中直接播入土壤的方法。胶中直接播入土壤的方法。干燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚干燥包埋法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法。合物进行包埋的方法。水凝胶法是指用通过离子交换或温度突变形成的凝胶水凝胶法是指用通过离子交换或温度突变形成的凝胶包裹材料进行包埋的方法。包裹材料进行包埋的方法。以海藻酸钠作包埋剂的操作程序在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀（添

17、加糖、防腐剂、抗生素、农药等，防止病虫害侵染）。将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子。用无菌水漂洗20min，以终止反应。 海藻酸钠易失水干缩，为克服此弱点，采用二重结构，即在胶囊中包埋培养液、保水剂，使体胚悬浮于培养基中，为防止发芽时杂菌感染，添加抗菌剂等。 理想的人工种皮具有一定的封闭性以保证人工胚乳的各种成分不易流失，同时又具有良好的透气性。具有一定的坚硬度，以加强人工种子的耐储运性和适于机械化操作。无毒无害，能保证繁殖体顺利穿透发芽。配制简单易行，成本低。常用的人工种皮材料早期使用早期使用Elvax 4260 4260涂膜，价格昂贵，操作复杂、包涂膜，价格昂贵，操作复杂、包裹效果不尽人意。裹效果不尽人意。新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的新近试验使用的二氧化硅化合物材料包括疏水的Tullanox和微亲水的和微亲水的Cab-O-Sil，二者均可以粉末状包，二者均可以粉末状包裹在人工种子胶囊外层，操作时只需将胶囊在上述材裹在人工种子胶囊外层，操作时只