DNA的复制和逆转录2015-1

1、DNA的生物合成的生物合成DNA Biosynthesis ( Replication )复制复制(replication) 是以是以DNA为模板的为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。聚合反应。 复制复制亲代亲代DNA子代子代DNAn本章主要内容：本章主要内容： DNA DNA复制的基本规律复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化 原核生物原核生物D

2、NADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA生物合成过程生物合成过程 逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式 DNADNA损伤与修复损伤与修复 DNA复制的基本复制的基本规律规律Basic Rules of DNA ReplicationnDNA复制的主要特征复制的主要特征 n半保留复制半保留复制的概念的概念: :半保留复制是半保留复制是DNADNA复制的基本特征。复制的基本特征。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGT

3、GACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNAn子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度实验密度梯度实验: : 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含含15N-DNA的细菌的细菌培养于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序

4、列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。n半保留复制的意义半保留复制的意义: :遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制复制33 5 3 5

5、解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand) 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为这股链称为领头链领头链(leading strand) 。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为链称为随从链随从链(lagging strand) 。复制中的不连。复制中的不连续片段称为续片段称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。

6、 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。制的半不连续性。 DNA复制的酶学和拓扑学变化复制的酶学和拓扑学变化The Enzymology and Topology of DNA Replicationn参与参与DNA复制的物质复制的物质: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶，简写为简写为 DNA-pol； 模板模板(template): 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 引物引物(primer): 提供

7、提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次聚合；聚合； 其他的其他的酶和蛋白质因子酶和蛋白质因子。(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPiRNA引物引物RNA引物引物子代子代DNA 活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能

8、辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性:?能切除突变的能切除突变的 DNA片段。片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。n核酸外切酶活性核酸外切酶活性: : （一）原核生物有（一）原核生物有3种种DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶可

9、能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I可能可能不可能不可能可能可能基因突变后的致死性基因突变后的致死性无无无无有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性20？400分子数分子数/细胞细胞多亚基不对称多亚基不对称二聚体二聚体？单肽链单肽链组成组成250120109分子量分子量(kD)DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol

10、In功能：功能： DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。中出现的空隙进行填补。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然

11、能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。个核心酶个核心酶1个个 -复合物（复合物（ 、 、 、 、 、 6种亚种亚基）基）1对对 -亚基（可滑动亚基（可滑动的的DNA夹子）夹子）DNA聚合酶聚合酶全酶结构全酶结构多聚体不对称多亚基二聚体多聚体不对称多亚基二聚体全酶结构包括：全酶结构包括：（二）常见的真核细胞（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有聚合酶有5种种DNA-

12、pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在线粒体在线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶

13、酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol填填补补引引物物空空隙隙，切切除除修修复复，重重组组延延长长子子链链的的主主要要酶酶，解解螺螺旋旋酶酶活活性性线线粒粒体体DNA复复制制低低保保真真度度的的复复制制起起始始引引发发，引引物物酶酶活活性性功功能能+-3 5 核核酸酸外外切切酶酶活活性性高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD）DNA-pol二、二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功聚合酶的碱基选择和校对功能

14、实现复制的保真性能实现复制的保真性 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性：此外还需酶学的机制来保证复制的保真性： 核酸外切酶的校读活性和碱基选择性是复核酸外切酶的校读活性和碱基选择性是复制的保真性的分子基础。制的保真性的分子基础。遵守严格的碱基配对规律，遵守严格的碱基配对规律，A-T配对，配对，G-C配对；配对；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。复制出错时有即时校对功能。nDNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的

15、保真性至少要依赖三种机制：A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能三、复制中的解链伴有三、复制中的解链伴有DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (g

16、yrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质E. Coli 基因图基因图（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单

17、链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于氢键，使氢键，使DNA双链解开成为两条单链。双链解开成为两条单链。引物酶引物酶(primase) 复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶。引物的酶。单链单链DNA结

18、合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整态并保护单链的完整。 108局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶改变拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态超螺旋状态n复制过程正超螺旋的形成：复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成 既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键。、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶n拓扑异构酶分类：拓扑异构酶分类：n拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶作用特点：拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断D

19、NA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。n作用机制：作用机制：n拓扑酶的作用方式：拓扑酶的作用方式：四、四、DNA连接酶连接复制中产生的连接酶连接复制中产生的单链缺口单链缺口连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生