临床免疫学免疫组织化学技术

1、第十二章免疫组织化学技术免疫组织化学技术是指组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物。对相应抗原或抗体进行定位、定性或定量检测。其原理仍是抗原抗体的反应，应用酶标记物通过酶与它底物间的组织化学反应生成不溶性颜色产物，用显微镜在细胞或亚细胞水平上观察抗原或抗体的存在、定位及分布。第一节免疫组织化学技术要点一、标本的处理（一）标本主要来源组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜组织，后者是机体死亡2h以上的组织，可能有不同程度的自溶，其抗原可能有变性消失，严重弥散现象，因此，尸检组织应尽快固定处理，以免影响免疫组化标记

2、效果。但有些较稳定性抗原，如HBsAg、HBcAg等在尸检标本中，抗原显示仍较好。组织标本的取材常常受到各种因素的影响，如各种内窥镜钳取的组织，常因过度挤压而变形，严重者组织结构被破坏。大组织标本病变分布广泛，抗原在组织中分布不均一，常出现人为的组织取材不准确。为了避免上述缺点，组织取材时应注意：活检钳的刃口必须锋利，以免组织受挤压；取材部位必须是主要病变区；必须取病灶与正常组织交界区；必要时取远距病灶区的正常组织作对照。（二）标本的固定与保存为充分保存组织的抗原性，标本离体后应立即作处理，或立即速冻成冻块进行冰冻切片，或立即用固定液固定进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于

3、液氮罐内或-70冰箱内备用。1.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同。因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。而HBsAg属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。2.固定剂：用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下

4、。（1）醛类固定剂：双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。（2）非醛类固定剂：Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。（3）丙酮及醇类固定剂：系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其

5、它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。选择最佳固定液标准是：最好地保持细胞和组织的形态结构。最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。固定组织时应注意：应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚，必须小于2cml.5cm0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内

6、。固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。3.切片方法的选择：应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5m左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100m，有利于追踪神经纤维的走行。（1）冰冻切片：是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。冰冻时，组织中水分易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中

7、上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33，从-30降至-43之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。（2）石蜡切片：其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：脱水、透明等过程应在4下进行，以尽量减少组织抗原的损失。组织块大小应限于2cm1.5cm0.2

8、cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度27m，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象，切片如需长期贮存，可存放于4冰箱内备用。石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包

9、埋法，可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。（3）振动切片：用振动切片机，可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片2010m，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保

10、留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其适用于免疫电镜观察。（4）塑料切片：塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类（GMA）及环氧树脂类（Epon 812，618），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至0.52m，故称半薄切片。GMA保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如Fpon和Araldite能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不

11、易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。二、抗体的处理与保存抗体是免疫组织化学技术的首要试剂，目前国内外市场提供有多种特异性抗体，基本能满足工作的需要。如自制的异种抗血清，可用特异性抗原进行亲和层析，去除非特异性抗体，或将抗体稀释处理。三、免疫染色通常的程序是：标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物；用缓冲液冲洗去未结合的成分；镜下观察结果。四、设立对照试验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，在实验中

12、必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、自身对照和吸收试验等。第二节酶免疫组织化学技术免疫酶细胞化学是免疫细胞化学中最常用的方法之一，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质（抗原抗体）在组织细胞内存在部位的一门新技术：即预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。一、酶标抗体法免疫酶标抗体技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了

13、解疾病的发病机制和病理过程。基本原理：酶标抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。二、非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如：酶与抗体间

14、的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP法）。现分述如下。（一）酶桥法1.基本原理：首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节省第一抗体

15、的用量。2.染色步骤酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故两者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。（二）PAP法1.PAP的特征：PAP复合物的形成不同于其他抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性P

16、AP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为ll.5s，分子量为400430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H202-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物

17、的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。2.PAP染色原理及步骤（1）原理：与酶桥法相似。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似。3.PAP法的评价：PAP法应用比较广泛，特别是近几年，PAP、ABC等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。三、酶标记亲和素-生物素技术方法基本原理：标记亲合素-生物素法（LAB法）：将亲合素与标记物（HRP）结合，一个亲合素可结合多个HRP；将生物素与抗体（一抗与二抗）结

18、合，一个抗体分子可连接多个生物素分子，抗体的活性不受影响。细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体结合，继而将标记亲合素结合在抗体的生物素上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。桥连亲合素-生物素法（BAB法）：先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游离亲合素将生物素化的抗体与酶标生物素搭桥连接，也达到多层放大效果。亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法（ABC法）；此法是前两种方法的改进，即先按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大

19、大提高了检测抗原的灵敏度。第三节荧光免疫组织化学技术荧光免疫组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons等（1950）建立，经过近43年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。它与亲合化学技术如葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中

20、应用单克隆抗体日益增多，将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性，在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。免疫荧光组织化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。一、直接法1.检查抗原法：这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法很特异和简便，但一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。2.检查抗体法将抗原标记上荧光素，即为荧光抗原，用此荧光抗原

21、与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体定位检测出来。二、间接法1.检查抗体法（夹心法）：此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。2.检查抗体法：用已知抗原细胞或组织标本的切片，加上待检血清，如果其中含有切片中某种抗原的抗体，抗体便沉淀结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应（如检测人血清中的抗体必需用抗人IgG荧光抗体等），在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。3.检查抗原法双

22、薄片：此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体，种属特异性）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3至4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示。这是现在最广泛应用的技术。三、补体法1.直接检查组织内免疫

23、复合物法：用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体补体复合物-抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物的存在处。此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。2.间接检查组织内抗原法：常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原补体抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体-抗补体荧光抗体的复合物；此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的标记显示。四、双标记荧光免疫法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时，要进行双重荧光染色，一般均

24、采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。第四节免疫金（银）组织化学技术一、免疫胶体金特性1.胶体金特性：胶体金也称金溶胶，是由金盐被还原成金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuCl2-），外层离子层H+则分散在胶体金溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。蛋白质有保护胶体金稳定性作用。（1）胶体性质：胶体金具有胶体的多种特

25、性，尤其是对电解质的敏感性（使其沉淀）。（2）呈色性：微小颗粒胶体呈红色，不同大小的胶体金呈色有一定差别，最小的胶金是橙黄色；中等大小的胶体金是酒红色；较大颗粒的胶体金呈紫红色。（3）光吸收性：胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长在510550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化（颗粒越小，波长越短）。2.免疫金的特性：用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，常称为免疫金复合物，简称免疫金。二、免疫金（银）染色1.免疫金（银）染色原理：在金免疫技术基础上发展起来的更为敏感的技术。利用金免疫技术测定的产物上的金颗粒可将银离子还原成银颗粒，在金颗粒表面形成一色泽更

26、深的黑色层，因而增强了金免疫技术的敏感性。多用于组织化学检测。2.主要试剂：银染液。3.应用：金银染色提高了金免疫技术的敏感度，可替代荧光免疫技术以及以膜为载体的酶免疫法。金免疫技术的敏感度低于其他标记免疫技术，经银加强染色后敏感度可与荧光免疫技术和酶免疫技术相当。第五节免疫标记电镜技术一、免疫标记电镜技术的原理是利用电镜下可见的示踪标记物标记特异性抗体（或抗原），使之与组织超薄切片中的相应抗原（或抗体）反应，形成不溶性免疫复合物，用电镜观察可见的标记物，间接证实免疫反应的发生。二、常用的免疫标记电镜技术（一）铁蛋白标记免疫电镜技术铁蛋白是一种含铁约占23%的蛋白质，分子量460kD，直径10

27、-12m。抗体与铁蛋白通过低分子量的双功能试剂结合为一种双分子复合物。此复合物既保留抗体的免疫活性，同时因为铁蛋白含有致密的铁离子核心，铁胶粒直径核心为5560nm含20003000个铁原子，分布于四个区域，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，便于电镜观察。铁蛋白来自许多动物，以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高。因而，商品铁蛋白主要是从马脾脏中提取的。（二）酶标记免疫电镜技术是以酶作为抗原抗体反应的标记物，在既不改变抗原抗体的免疫反应特异性也不影响酶活性的条件下，与相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。在光学显微镜下观察时，要求反应的终末产物是不溶性的有色物质，具有可观察性。在电镜

28、下观察时，则要求底物的终末产物具有较高的电子密度。由于辣根过氧化物酶具有稳定性强和反应特异性高等优点，是目前应用最多的酶标记物。实验方法包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶-抗过氧化物酶技术（即PAP法）。（三）胶体金标记免疫电镜技术标记金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。它是利用胶体金在碱性环境中带有负电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取

29、得了可喜的进展，解决了一些过去未能解决的问题，80年代以来似有取代免疫电镜PAP技术的趋势。胶体金标记抗体技术在电镜水平应用有许多优点：首先，手续不如PAP法烦琐，不需用H202等损伤微细结构的处理步骤，对微细结构的影响较少。其次，金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒清晰可辨，易于与其他免疫产物相区别。因此，金标法还可以和PAP法相结合进行双重或多重染色的超微结构定位。另外。利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突触小泡内神经递质共存的有力工具。由于抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可进行粗略的免疫细胞化学定量研究。金标抗体还可加入培养液中，对培养细胞内抗原进行标记定位。曾有报告用金

30、标记法于细胞内骨架的研究获满意的效果。由于金具有强烈的继发电子的能力，因此，不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。金标液无毒性，对人体无损伤。第六节免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术主要应用范畴：1.在细胞学方面的应用：对于细胞抗原性物质能准确、敏感地进行检测和定位。2.在微生物学方面的应用：在细胞学中主要用于菌种鉴定和抗原结构的研究。3.在寄生虫学中的应用：检测人体大多数寄生虫，且具有特异性高和敏感性好等优点。4.在临床病理学的应用：确定肿瘤的组织学发生，进行肿瘤的转移性和特异性的鉴别，辅助识别肿瘤的良、恶性，癌前病变和癌。5.自身

31、免疫性疾病中的应用：应用免疫荧光抗体间接法可以检出自身免疫疾病患者血中的自身抗体。习题65胶体金的特性有A.胶体性质B.呈色性质C.还原性质D.发光性质E.光吸收性答疑编号1正确答案A、B、E习题66关于胶体金特性的叙述中，错误的是A.颗粒稳定，均匀地分散悬浮在液体中B.电解质可使胶体金沉淀C.较大颗粒的胶体金是橙黄色D.蛋白质有保护胶体金稳定性作用E.颗粒越小，其吸收波长越短答疑编号2正确答案C习题67关于斑点金免疫渗滤试验双抗体夹心法的叙述，正确的是A.以硝酸纤维素膜为载体B.用胶体金标记抗原C.首先滴加纯化的抗体试剂D.膜中央出现红色斑点为阴性反应E.斑点颜色的深浅提示阳性的强弱答疑编号

32、3正确答案A、C、E答案解析首先滴加纯化的抗体试剂，渗滤过膜时标本中的抗原被抗体捕获，再加入金标记抗体与被捕获在膜上的抗原结合呈色，其颜色颜色的深浅反应抗原量的多少（阳性强弱）。第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.0751.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.0301.035之间。因而可利用一种比重介于1.0751.092之间，而近于等渗

33、的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，

34、故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。图 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。图 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生

35、出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有：粘附贴壁法；吸附柱过滤法；磁铁吸引法。2.淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。常用的方法包括：E花环沉降法；尼龙毛柱分离法；亲和板结合分离法；磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。三、淋巴细胞的保存与活力测定1.

36、淋巴细胞的保存技术（1）短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMIl640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4保存。（2）长期保存技术：液氮深低温（-196）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。2.活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。第二节淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志的检测 1.特异性抗原检测：用单克隆抗体检测T

37、细胞表面抗原的方法有两大类：一类是用标记抗体染色，如免疫荧光法、酶免疫法、ABC法及免疫金银染色法；另一类用抗体致敏的红细胞作花环试验。2.特异性受体的检测原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体，当人的T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混合后，置4至少2小时或过夜，T细胞表面的E受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样的花环，称为活性E（Ea）花环。检测Ea花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平。3.T细胞亚群检测：见第二十二章流式细胞仪分析技术。二、B细胞表面标志的检测B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细

38、胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息。1.B细胞表面抗原的检测：B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测。2.SmIg的检测：大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高特异性和高亲和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig，即IgM、IgG、IgA、IgE等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有SmIgM的细胞

39、数为最多。B细胞经荧光标记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同的形式，开始均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。这一现象是由于淋巴细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动。当SmIg抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状，时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。三、自然杀伤细胞（NK）及功能的检测NK细胞表面至少存在CD2、CD11

40、b、CD11c、CDl6、CD56和CD69等多种抗原，但均非NK细胞所特有，因此极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，现多检测NK细胞活性，因NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，它能直接杀伤靶细胞。测定人NK细胞活性多以K562细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK细胞活性则用YAC细胞株，检测方法多种多样。1.形态法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，继用台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理，然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，推算NK细胞活性。2.酶释放法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释放出的酶含量。3.荧光法：用荧光素标记靶细胞，经与

41、效应细胞共温后，离心去上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光。4.核素法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合共温后，离心检测上清液或剩余靶细胞放射性的量，间接反映其活性。方法有靶细胞胞浆释放法和胞核释放法两种。5.化学发光法：当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸暴发，生成极不稳定的O2-及OH-，放出光子，在发光剂存在条件下，可被光电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。第三节淋巴细胞功能检测技术一、T细胞功能的检测 1.T细胞增殖试验：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，在2448h内细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞

42、变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又称为淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。（1）非抗原性刺激物：如植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS），通称促有丝分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B类细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。（2）抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。2.T细胞增殖试验类型（1）形态法：其原则是将外周血液或分离的单个细胞与适量的植物血凝素（PHA）混合，置37培养72h

43、，取培养细胞作涂片染色镜检。据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，计算转化率。（2）核素法：绝大多数外周血T细胞通常处于细胞周期的G0期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0期进入G1期，开始合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加入3H标记的TdR，后者掺入新合成的DNA中，据掺入的多少推测细胞增殖程度。3.T细胞介导的细胞毒试验：T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细

44、胞的特性，凡致敏T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。该试验原则是选用适当的靶细胞（常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株），经培养后制成一定浓度的细胞悬液，按一定比例与待检的淋巴细胞混合，共温育一定时间，观察肿瘤细胞杀伤的情况。二、B细胞功能的检测1.B细胞早期活性指标的测定：B细胞经不同抗原激发即开始分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪器加以检测。激活的B细胞表面MHC类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC法检测。2.溶血空斑形成试验：经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，其原理

45、是将绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置37温育。由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。这种直接法所测的细胞为IgM生成细胞，其他类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA与抗Ig抗体结合成复

46、合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验。但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。如果用一定方法将SRBC用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的应用范围较大。现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验。SBA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围。在该测试系统中，加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc段可与连接在SRBC上的SP

47、A结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。此法可用于检测人类外周血中的IgG产生细胞，与抗体的特异性无关。用抗IgA、IgG或IgM抗体包被SRBC，可测定相应免疫球蛋白的产生细胞，这种试验称为反相空斑形成试验。3.B细胞增殖能力的试验（1）不同刺激物诱发增殖试验：抗IgM抗体和细菌脂多糖均能刺激B细胞增殖，培养13天以后，加3h-tdr，与淋巴细胞增殖试验一样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度。（2）葡萄球菌诱导试验：葡萄球菌coweni株（SAC）表面富含SPA。该试验不依赖T细胞的参与，操作原则是将SAC与淋巴细胞按一定比例混合，按增殖试验法同样操作和计数cmp值。葡萄球菌表面SPA含量与激发B细胞转化能力成正比。溶血空斑形成试验可用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，或评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能。第四节免疫细胞检测的临床意义T细胞功能检测主要用于判断细胞免疫