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1、9 第二代基因工程 -蛋白质工程 9.1 蛋白质工程的基本概念 简介 以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过分子设计，把 蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。蛋白质工程 的实践依据dna指导合成蛋白质。 因此，可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新 设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。 一、蛋白质工程的概念 研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计 一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因 结构，从而产生新的蛋白质;或者从蛋白质结构与功能的 关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能 基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。 注意：由于蛋白

2、质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有 诸 多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程。 蛋白质工程研究历史 1 1953年，英国生物化学家桑格破译出由17种51个氨基酸组成的两条 多肽链牛胰岛素的全部结构。 2 1958年开始， 中国科学院上海生化研究所、上海有机化学研究所 和北大生物系三个单位联合用化学方法合成胰岛素。蛋白质工程第一 个十分成功的范例是胰岛素的人工合成。 3 1965年，中国科学院和北京大学生物系联手首次人工合成了牛胰岛 素，成了轰动世界的大事。 4 1983年，美国生物学家额尔默首先提出了 “蛋白质工程”的概念。 蛋白质工程的研究内容 1

3、 通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效； 2 通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在极端条件下的 稳定性，如酸、碱、酶稳定性； 3 通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能力，不再需 要辅助因子； 4 通过改变蛋白质的特性，使其便于分离纯化，如融合蛋白b- 半乳糖苷酶（抗体）； 5 通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离，解除反馈 抑制作用等。 改变蛋白质的遗传信息 改变蛋白质的组成和空间结构 改变蛋白质的特性便于分离 蛋白质工程的研究内容 方法有： 1 在蛋白质分子中引入二硫键以提高蛋白质的稳定性； 2 减少半胱氨酸残基数目以避免错误折叠的可能性； 3 置换天冬酰胺、谷氨酰胺或其

4、他氨基酸，以修饰酶的催 化特异性或增加酶的活性等。 相关教材 蛋白质工程实施的必要条件 前提条件 了解蛋白质结构与功能的对应关系 结构域：维持蛋白质特定空间构象 功能域：赋予蛋白质特定生物活性 化学键：共价键（肽键，二硫键） 非共价键（疏水键，离子键，氢键） 9.2 基因的体外定向突变 （一）、基因定点突变 是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。 （二）、蛋白质设计 依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，按照蛋白质构效关系的理 论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。 9.2 基因的体外定向突变 基因的定向诱变 在dna水平上产生多肽编码顺序的特异性改变。 基因定向突变

5、的策略 1 局部随机掺入法（图9-2） 2 碱基定点转换法（图9-3） 3 部分片段合成法（图9-4） 4 引物定点印入法（图9-5，9-6） 酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求，而且天然酶的稳定 性差、活性低使催化效率很低，还缺乏有商业价值 的催化功能 天然酶的局限天然酶的局限 天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。 9.3 基因的体外定向进化 又称实验分子进化, 属于蛋白质的非合理设计 （irrational design），它不需事先了解酶的空 间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件， 模拟自然进化机制（随机突变、重

6、组和自然选 择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性 质的突变酶。 分子定向进化的主要过程 1 通过随机突变或基因重组，创造一个靶基因或一群家族基因 的多样性文本，建立突变文库。 2 突变文库在受体生物中转换成对应的蛋白变体库。 3 高通量筛选，检出由氨基酸置换而引起的变体蛋白性状变化， 从而确定该氨基酸在蛋白质分子中的作用。 定向进化的原理定向进化的原理 人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外 对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然 的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个 人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望 的具有某些特性的

7、进化酶。 定向进化技术定向进化技术 定向进化与自然进化的异同点定向进化与自然进化的异同点 定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应 用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使 进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同： 进化动力不同： 保守突变 非保守取代； 进化方向不同： 适应突变的积累； 进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天； 进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要求，探索 所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。 易错易错pcrpcr 易错 pcr（error prone pcr）是指在扩增目的基因 的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。 连续易错pc

8、r (sequential error prone pcr)策略。 即将一次pcr扩增得到的有用突变基因作为下一次 pcr扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。 易错易错pcr应用应用 举例 用在非水相（二甲基甲酰铵, dmf）溶液中定向进化枯草 杆菌蛋白酶e的活性获得成功，所得突变体pc3在60%和85% 的dmf中, 催化效率kcat/km分别是野生酶的256和131倍, 比活性提高了157倍. 将pc3再进行两个循环的定向进化 2, 产生的突变体13m的kcat/km比pc3高3倍(在60%dmf 中), 比野生酶高471倍. dnadna改组和外显子改组改组和外显子改组 dna改组(dn

9、a shuffling)又称有 性pcr (sexual pcr)，原理如图 所示。 外显子改组(exon shuffling 类似于dna改组，与但与其不同， 它是靠同一种分子间内含子的同 源性带动，而dna改组不受任何限 制，发生在整个基因片段上。 dna改组和外显子改组 dna改组（dna shuffling）策略的目的 创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 导致更大 的变异, 最终获取最佳突变组合的酶. 通过dna改组, 不 仅可加速积累有益突变, 而且可使酶的2个或更多的已优 化性质合为一体。 外显子改组（exon shuffling） 类似于dna改组，两者都是在各自含突变的

10、片段间 进行交换， dna改组和外显子改组的区别 dna改组 尤其适用于真核生物. 在自然界中, 不同分子的内含子间发生同源重 组, 导致不同外显子的结合, 是产生新蛋白质的有效途径之一. 外显子改组 靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而dna改组不受任何限制, 发 生在整个基因片段上. 外显子改组可用于获得各种大小的随机肽库. 体外随机引发重组 体外随机引发重组 以单链dna为模板，配合一套随机序 列引物，先产生大量互补于模板不 同位点的短dna片段，由于碱基的错 配和错误引发，这些短dna片段中也 会有少量的点突变，在随后的pcr反 应中，它们互为引物进行合成，伴 随组合，再组装成完整的

11、基因长度。 交错延伸 原理 在pcr反应中把常规的退火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时 间(55, 5 s), 从而只能合成出非常短的新生链, 经变性的新生链 再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸.此过程 反复进行, 直到产生完整的基因长度, 结果产生间隔的含不同模板序 列的新生dna分子(图9-11). 注意：step法重组发生在单一试管中, 不需分离亲本dna和产生的重组dna. 它采用的是变换模板机制, 这正是逆转录病毒所采用的进化过程。该法简便 且有效, 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具. 交错延伸 杂合酶杂合酶 把来自不同酶分子中的结构单元（二级结构、三级

12、结构、 功能域）或整个酶分子进行组合或交换, 以产生具有所需 性质的优化酶杂合体. 产生杂合酶途径 如定位诱变、dna改组、不同分子间交换功能域，甚至整 个分子融合. 目标酶所需功能方法结果实施菌种 卡那霉素核苷基 转移酶 热稳定性定位诱变+选择在60-50酶半衰期 增加200倍 耐热脂肪 芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶 剂 易错pcr+选择在60二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 枯草杆菌 -内酰胺酶作用于新底物dna改组+选择对cefotaxime的抗性 增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶有机溶剂中的 底物特异性和 活性 易错pcr+重组活力增加60-150倍大肠杆菌 胸苷

13、激酶第五特异性 基 因理疗 交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌 -半乳糖苷酶底物特异性dna改组+选择活力增加66倍底物特 异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径砷酸抗性dna改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌 定向进化的应用定向进化的应用 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 二、蛋白质工程的一般技术 （一）、蛋白质工程的理论设计 活性设计：考虑被研究的蛋白质的功能，涉及选择化学基团及其空间取向。 专一性设计：指功能性蛋白质在发挥其生理功能的时，总是与其他分子发生 专一性相互作用。 框架设计：是指对蛋白质分子的立体设计。 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 蛋白质工程酶 1.改变酶的催化活

14、性 2.改变酶的底物专一性 3.提高酶的稳定性 4.改变酶的反应特性 5.产生新酶 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 1 提高蛋白质或酶的稳定性 （1）引入二硫键以提高蛋白质或酶的稳定性。参考表9-2 （2）转换氨基酸残基以提高蛋白质或酶的稳定性。参考表9-3 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 2 减少蛋白质重组多肽链的错误折叠。参考图9-17 3 改善酶的催化活性 （1） 转换氨基酸残基以改善酶的催化活性 参考图9-18和表9-5 （2）随机改组肽段以改善酶的催化活性 参考图9-19a、b （3）删除末端部分氨基酸序列以改善酶的催化活性 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 4 消除酶的被

15、抑制特性 （1）转换氨基酸残基以消除酶的被抑制特性。 （2）删除肽段以消除酶的被抑制特性。 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 5 修饰酶的催化特异性 （1）共价结合寡核苷酸以修饰酶的催化特异性。 参考图9-20 （2）转换氨基酸残基修饰酶的催化特异性。 参考图9-21，9-22 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 6 强化配体与其受体的亲和性 （1）随机点突变以强化配体与其受体的亲和性。 参考图9-23 （2）基因家族改组以强化配体与其受体的亲和性。 参考图9-24 9.4 蛋白质工程的设计思想与应用 7 降低异源蛋白药物的免疫原性 参考图9-25 10 第三代基因工程 -途径工程 途径工程

16、 第一代基因工程 单基因的克隆和表达的dna的重组 第二代基因工程 在基因水平上对蛋白质的结构与功能进行局部修饰 第三代基因工程 利用dna重组技术对生物细胞内固有代谢途径和信号转导途径进行改 造和设计 途径工程 根据底物在代谢中对通用美和特异酶的使 用要求，细胞内的生物分子分为： （1）一级基因产物，通用性的酶及蛋白因子，包 括rna聚合酶等。 （2）二级基因产物，特异性的酶。 途径工程基本概念 是多基因的基因工程。通过基因工程的手段来改变分叉代 谢途径的流向或阻断有害代谢产物的合成等原理，来改变 微生物代谢的流向，增加某些产物的产量，也可通过引入 外源基因来延伸原来的代谢途径，产生新的末端代谢产物， 或者利用新底物作为生物合成的原料，也可以通过构建新 的代谢途径合成具有新化学结构的代谢产物。 途径工程基本过程 1 靶点设计 2 基因操作 3 效果分析 途径工程基本原理 目标 通过定向组合细胞代谢途径和重构代谢网络，达到改良生物体遗传性状之目的。 基本原理 1 涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理 2 涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理 3 涉及途径代谢流推动力的酶学原