氧化苦参碱对小鼠局灶性脑梗死的保护作用

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减氧化苦参碱对小鼠局灶性脑梗死的保护作用(作者：单位：邮编：)【摘要】 目的 观察氧化苦参碱(OMT)对小鼠局灶性脑梗 死(CI)的保护作用。方法 健康成年雄性昆明小鼠随机分为假手术组、 模型组以及OMT预处理组。用线栓法制作小鼠永久性大脑中动脉闭 塞模型。假手术组及模型组术前30 min腹腔注射0.9%生理盐水4 ml， OMT组腹腔注射OMT 35 mg/kg。记录小鼠清醒后神经功能缺损程 度，TTC染色测定梗死体积，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性，TBA 法测定MDA含量，TUNEL法测定细胞凋亡。结果 与模型组相比， OMT组小鼠术后24 h神经功能缺

2、损评分下降，梗死体积缩小，SOD 活性升高，MDA含量减少，神经元凋亡减轻。结论 OMT可能通过 提高SOD活性起到对小鼠局灶性CI的保护作用。【关键词】 脑梗死;氧化苦参碱;保护作用氧化苦参碱(OMT)具有抗炎、抗氧化、抗病毒及免疫调节等多方面 的药理作用1, 2，一直用于病毒性肝炎及免疫调节方面的治疗， 但在脑血管疾病方面尚无尝试。本实验制作小鼠永久性大脑中动脉闭 塞模型，观察OMT对脑梗死（CI）小鼠神经功能缺损、梗死体积、超 氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及神经元凋亡的影 响，探讨OMT对CI是否具有保护作用及可能机制。1材料与方法1.1实验动物与分组 健康成年雄性

3、昆明小鼠45只，体重35 40 g,长春医学高等专科学校动物中心提供，随机分为假手术组、模 型组及OMT预处理组，每组15只。1.2主要仪器及试剂 恒冷箱冷冻切片机（Leica，德国），倒置荧 光显微镜（Nikon，日本），紫外分光光度计（CE2041，北京）。主要试 剂：SOD、MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供 ；一步法 TUNEL凋亡检测试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所提供。1.3模型制作及给药方法 小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型制 作参考文献3。小鼠以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉， 仰卧固定，常规备皮、消毒后颈部正中切口，分离暴露右侧颈总动脉 及颈内外动脉，结扎

4、颈总动脉近心端及颈外动脉起始部，颈总动脉靠近分叉处套线备用，动脉夹暂时夹闭颈内动脉。在距离颈总动脉分叉 处2 mm左右处剪一小口，插入单股尼龙线（长3 cm，直径0.104 mm， 于1、2、3处分离标记）约11 mm，有轻微阻力时停止，扎紧缝线， 剪掉多余线栓，缝合并再次消毒皮肤。假手术组除不插线外，其余步 骤相同。术中用白炽灯加温维持小鼠肛温约 37C。OMT为陕西慧科 植物开发有限公司，纯度 98%，生产批号SF20061215，临用时以 蒸馏水制成混悬液。OMT预处理组在手术前30 min腹腔注射OMT 35 mg/kg。各组小鼠均在手术后24 h处死。1.4观察指标（1）神经功能缺损

5、评分：清醒后对小鼠神经功能 缺损进行评分4。0级为无神经功能缺失症状;1级为左前爪不能完 全伸展;2级为轻轻向后牵拉鼠尾并将后肢提起，左前爪抓力明显减 低;3级为运动自如，但牵拉鼠尾时会向左侧倾斜或转圈；4级为向左侧倾斜或划圈运动；5级为刺激后运动;6级为刺激无运动，伴有意识 障碍；7级为死亡;07分别为07分。选取15分小鼠进行相应指 标检测，每组15只。（2）红四氮唑（TTC）染色测定梗死体积：3组大 鼠中每组各取5只，手术后24 h快速断头取脑，-20C冷冻20 min 后行1 mm厚冠状切片，立即置于1%TTC溶液中37 C恒温避光孵 育30 min，正常脑组织为红色，梗死为白色。染色

6、的切片经扫描后 接入电脑。用lmage_Pro软件进行图像分析，计算梗死体积百分比。 （3）SOD活性以及MDA含量测定：每组小鼠各取5只快速断头取脑， 冰盘中分离出右侧额顶部脑组织，滤纸吸干水分，称重后制成10%组织匀浆，4 C 3 500 r/min离心10 min后取上清液，考马斯亮蓝 法测定蛋白含量，按照试剂盒说明书操作。TUNEL法测定细胞凋亡：每组小鼠各取5只，术后24 h经麻醉后迅速开胸，暴露心脏， 经左心室插管至升主动脉，剪开右心耳，先用0.1 mol/L预冷PBS 100 ml灌注至清澈，再用预冷4%多聚甲醛灌注150 ml。断头取脑，37C 4%多聚甲醛后固定4 h，流水漂

7、洗过夜，5%、10%、15%、20%、 25%、30%梯度蔗糖脱水直至沉底，用冰冻切片机做连续冠状切片， 片厚6呵。切片经室温晾干，用含有1% Trit on X 100的PBS洗涤3血min，按照TUNEL检测试剂盒说明书配制检测液，在样品上加50 检测液，37 C避光孵育60 min，孵育至45 min时加入DAPI 复染。PBS避光洗涤3$ min，油封片后在荧光显微镜下观察染色阳 性的细胞。每组5张切片，每张切片取5个互不重叠的视野计算染色 阳性的细胞百分比。正常细胞核为蓝色，凋亡的细胞胞核为黄绿色。1.5统计学处理 计量资料以xs表示，采用单因素方差分析。2结果2.1各组小鼠神经功能

8、缺损评分比较假手术组小鼠未见神经功能缺损症状(0分);模型组神经功能缺损较为明显(4.91 ).52)分， OMT预处理组神经症状明显减轻(2.58 ).37)分(P0.05)。2.2各组梗死体积比较假手术组未见病灶(0)，模型组以及OMT预处理组梗死灶主要位于右侧颞、顶叶皮质以及基底节区。其 中模型组平均梗死体积百分比(50.78 3.96)%较OMT预处理组(30.82 2.97)%明显增高(P0.05)。2.3各组SOD活性以及 MDA含量比较模型组SOD活性(55.32 5.69)U/mg 丨较假手术组(70.82 4.78)U/mg明显减低 (P0.05)，OMT 预处理组 SOD

9、活性(61.23 3.24)U/mg明显高于 模型组(P0.05)。模型组MDA含量(15.68 4.57)nmol/mg较假手 术组(6.48 i2.37)nmol/mg明显增高(P0.05);而 OMT 预处理组 MDA 含量(7.38 i2.56)nmol/mg丨则明显低于模型组(P0.05)。2.4各组细胞凋亡比较假手术组仅见少量凋亡细胞，凋亡率为(1.42 ).13)%;模型组凋亡细胞明显增多，凋亡率为(55.67 3.57)%， 远远高于假手术组（P0.05）。经OMT预处理后凋亡细胞虽然高于假手 术组，凋亡率为（35.19 3.24）%，但仍远远低于模型组（P0.05）。3讨论本

10、研究采用线栓法制作小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型，更符 合临床常见的CI发病过程。模型制作成功后梗死部位大多位于右侧 颞顶叶皮质以及基底节区。脑组织富含磷脂，梗死后组织缺血，大量 的自由基形成，引起生物膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，造成生物膜结构和功能破坏5。因此有效清除自由基是减轻脑缺血损 伤的靶点之一。SOD能催化0【2发生歧化作用，是清除细胞内自由 基，保护细胞免受氧化应激损伤的关键酶之一。脂质过氧化产物MDA含量可以高度反映神经元的毒性效应，作为主要的自由基清除剂， SOD的含量升高可阻止过氧化反应引起的组织损伤。在本实验中脑组织血液循环中断后24 h小鼠出现大面积脑梗死，SOD活

11、性下降，MDA含量升高，大量神经元凋亡。给予OMT预处理后，可提高SOD活性，降低MDA含量，从而使凋亡神经元 数量减少，梗死体积缩小，发挥保护神经元的功能。以上结果提示 OMT可使神经元对自由基的清除能力加强，抗脂质过氧化能力提高，提示升高SOD活性可能是其减轻脑组织缺血损伤的机制之一。【参考文献】1 Lu LG，Ze ng MD,Mao Y M,et al.Oxymatri ne therapy for chronic hepatitis B : a randomized double blind and placebo _c on trolled multice nter trial J. World J Gastrge nterol ，2003;9(11) : 24803.2 Zheng P, Niu FL, Liu WZ,et al.Anti inflammatory mecha nism of oxymatri ne in dextra n sulfate sodium in duced colitis of rats J.World J Gastroenterol , 2005;11 (31) : 4912 5.3席刚明，汪华侨，魏国耀，等.小鼠颈动脉系解剖与测量在局灶性脑缺血模型中的应用J.解剖学研究，2004;