谷胱甘肽的发酵优化及调控分析

1、 谷胱甘肽的发酵优化及调控谷胱甘肽的发酵优化及调控分析分析魏国光魏国光生物生物与制药工程学与制药工程学院院研究生研究生一班一班魏国光魏国光1234CONTENTS 谷胱甘肽的作用及代谢途径谷胱甘肽的作用及代谢途径合成合成谷胱甘肽限制因素谷胱甘肽限制因素发酵条件优化及调控策略发酵条件优化及调控策略调控策略分析调控策略分析一、什么是谷胱甘肽谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl (glutathione,r-glutamyl cysteingl +glycine,GSH)+glycine,GSH)是一种含是一种含-酰胺键和巯基的三肽，由酰胺键和巯基的三肽

2、，由谷氨谷氨酸酸、半胱氨酸半胱氨酸及及甘氨酸甘氨酸组成。组成。重要的功能团重要的功能团1 1 谷胱甘肽谷胱甘肽简介简介1.1 1.1 功能功能-SH：易于氧化物质和毒素结合，通过生物转化，将其排除体外，因此GSH起到抗氧化和解毒的作用。GSH:年需求量逐年上升，2015年世界需求量达到500吨。 谷胱甘肽的作用1.21.2 谷胱甘肽代谢途径谷胱甘肽代谢途径 谷氨酰半胱氨酸合成酶（谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH1GSH1）谷胱甘肽合成酶（谷胱甘肽合成酶（GSH2GSH2）主要的生产菌株为主要的生产菌株为酵母菌酵母菌和和大肠杆菌大肠杆菌2 合成谷胱甘肽限制因素（1 1）半胱氨酸的量制约半胱氨酸的量制

3、约GSHGSH的合成速度和合成量的合成速度和合成量，比如胞，比如胞内半胱氨酸量不足，则导致其合成下降。内半胱氨酸量不足，则导致其合成下降。（2 2）ATPATP的供给的供给（3 3）GSH1GSH1和和GSH2GSH2的活性的活性（4 4）GSHGSH的反馈调节机制的反馈调节机制，GSH1GSH1是一个调节酶，也是一个是一个调节酶，也是一个多功能酶，受终产物多功能酶，受终产物GSHGSH的负反馈调节，当的负反馈调节，当GSHGSH在细胞中积在细胞中积累一定量时，累一定量时，GSHGSH与酶分子的调节部位结合使酶中心变构与酶分子的调节部位结合使酶中心变构失活，从而抑制失活，从而抑制GSHGSH继

4、续合成继续合成。3 发酵条件优化及调控策略TITLE3.1 3.1 培养基优化培养基优化Liu等对葡萄糖、蛋白胨和硫酸镁运用Box-Behnken设计进行优化,考察它们对酿酒酵母产的影响,并分别用响应面法和神经网络进行分析,发现神经网络预测的生物量和产量误差更小,在优化后的培养条件下,GSH产量达到115.28mg/L,比优化前提高了73%.Cha等报道氨基酸、盐类物质和碳氮源对酿酒酵母FF-8产GSH的影响,通过单因素实验发现,3.0%葡萄糖、3.0%酵母粉、0.06%磷酸二氢钾和0.06%半胱氨酸对GSH生产最有效,在此YM条件下产量达到204mg/L,比在基本培养基下提高了2.27倍.C

5、LICK TO EDIT TITLE3.23.2 培养条件优化培养条件优化 在发酵过程中，主在发酵过程中，主要优化发酵要优化发酵温度、溶温度、溶氧、氧、PHPH、压力、接种、压力、接种量量等等, ,来调控谷胱甘肽来调控谷胱甘肽生产，提高产量。生产，提高产量。1.1.卫功元等在摇瓶和7L罐上研究了温度、pH和溶氧对产肮假丝酵母生产的GSH影响（1 1）较高温度）较高温度促进促进细胞增长细胞增长, ,较低较低温度温度更有利于更有利于GSHGSH产量产量的的提高提高（2 2）在）在分批发酵条件下分批发酵条件下, ,当当葡萄糖葡萄糖30g/L30g/L浓度浓度为留且为留且通气量通气量控制在控制在5L/

6、min5L/min时时, ,搅拌转速搅拌转速达到达到300r/min300r/min即即可满足细胞生长和合成对溶解氧可满足细胞生长和合成对溶解氧的需求。的需求。2.pH2.pH在在5.55.5时时对细胞生长对细胞生长和和GSHGSH合成合成最佳最佳, ,而不而不控制控制pHpH比控制比控制pHpH在在对细对细胞生长胞生长和和GSHGSH合成合成分别分别降低降低了了27%27%和和29%29%。3.Liang等利用环境氧胁迫策略来提高产肮假丝酵母中的GSH积累,在发酵过程中分三段对其进行氧胁迫后发酵过程中分三段对其进行氧胁迫后, ,使使分批发酵分批发酵GSHGSH产量达产量达218mg/L,21

7、8mg/L,含量达到含量达到, ,比对照分别比对照分别提高了提高了54.6%54.6%和和58.1%58.1%3.3 发酵调控策略发酵调控策略(1)(1)补料调控（高密度发酵）补料调控（高密度发酵） 补料补料分批发酵分批发酵是目前最有效的一种方式来实现高密是目前最有效的一种方式来实现高密度度培养。培养。 优点优点：避免避免底物浓度过高底物浓度过高, ,防止底物浓度过高产生的细防止底物浓度过高产生的细胞生长胞生长抑制抑制、目标产物得率、目标产物得率下降。下降。流加培养流加培养方式方式： 恒速恒速流流加加 指数指数流流加加 溶溶氧和氧和反馈控制流加反馈控制流加 乙醇和乙醇和pHpH反馈控制反馈控制

8、流加流加等等 （2 2）比生长速率调控）比生长速率调控 据据质量守恒质量守恒做出做出比生长速率比生长速率和和比产率比产率的数学模型的数学模型, , 通过通过控控制补料发酵过程中的制补料发酵过程中的底物流加速率来操控比生长速率底物流加速率来操控比生长速率, ,从而获从而获得最大得最大产量。产量。（3 3）前体补前体补加调控加调控 通过添加通过添加L-L-半胱氨酸半胱氨酸、谷氨酸谷氨酸、甘氨酸甘氨酸提高谷胱甘肽生产提高谷胱甘肽生产量。量。 4 4 发酵条件优化及调控策分析发酵条件优化及调控策分析（1 1）添加碳氮源（葡萄糖、蛋白胨等）添加碳氮源（葡萄糖、蛋白胨等）：GSHGSH是一种胞内产物，提高

9、细胞密度，是一种胞内产物，提高细胞密度，对提高对提高GSHGSH的总产量有着重要作用。的总产量有着重要作用。（2 2）提高溶氧）提高溶氧：增加增加DODO值，同样可以使细胞数量增加，并且在葡萄糖量提高，加值，同样可以使细胞数量增加，并且在葡萄糖量提高，加快快TCATCA循环，提高循环，提高ATPATP的生成量，从而促使合成谷胱甘肽速率加快。的生成量，从而促使合成谷胱甘肽速率加快。（3 3）添加）添加前体：前体： 按按1:1:11:1:1的比例的比例GluGlu、CysCys、GlyGly增加反应速率增加反应速率。TCAATPATP（4 4）添加金属离子）添加金属离子(Mg(Mg2+2+或或Mn

10、Mn2+2+）：提高）：提高GSH1GSH1和和GSH2GSH2活性，减小活性，减小GSH1GSH1反馈抑制反馈抑制作用，提高酶活。作用，提高酶活。LiLi等等比较了比较了恒速流加恒速流加、人工反馈控制流加人工反馈控制流加和和指数流加指数流加这这三种补糖策略对重组三种补糖策略对重组大肠杆菌大肠杆菌高密度培养高密度培养产产GSHGSH的的影响影响, ,发现指数流加最为理想发现指数流加最为理想, ,生物量生物量达到达到80g/L,80g/L,产量产量达到达到0.88g/L.0.88g/L.Wen Wen 等等在在酿酒酵母酿酒酵母T65T65发酵生产发酵生产GSHGSH时时通过通过正交设计正交设计和

11、和均均匀设计匀设计优化优化了了三三种前体氨基酸种前体氨基酸的添加的添加浓度浓度, ,补料分批发补料分批发酵后酵后使使GSHGSH最高最高产量产量达到达到2190mg/ml2190mg/ml。Wang Wang 等等在发酵过程中优化在一次添加三种前体氨基酸在发酵过程中优化在一次添加三种前体氨基酸的量的量, ,使发酵使发酵在在3838小时达到小时达到最高最高的的GSHGSH产量产量2020mg/ml2020mg/ml。同一细胞间同一细胞间不同细胞间不同细胞间（5 5）几种新型的代谢途径调控方式分析几种新型的代谢途径调控方式分析-GTP：-谷氨酰转肽酶谷氨酰转肽酶Opt1：寡肽转运体寡肽转运体1Gx

12、a1:谷胱甘肽谷胱甘肽转出转出ABC 蛋白蛋白1Gex1/Gex2:谷胱甘肽质谷胱甘肽质子子交换器交换器1进行过表进行过表答答LOGOADP1/GSH1/GSH2:12.7mg/lADP1/GSH1/GSH2:12.7mg/l增增加加了了4.34.3倍倍, ,高于高于ADP1 ADP1 2.42.4倍倍, ,和和6.96.9倍倍( (2.98 2.98 mg/l/OD)mg/l/OD)GSH1/GSH2:GSH1/GSH2:5.40mg/l/OD5.40mg/l/OD) )亲代亲代菌株菌株( (1.83mg/l)1.83mg/l)亲代菌株：亲代菌株：0.34 mg / l / OD)GSH1/

13、GSH2(0.53 mg/l/OD)1.6倍倍ADP1(1.51mg/ l / OD) 3.8倍倍ADP1/ GSH1/GSH2 (5.80mg/l/OD) 17.1倍倍以下的条形图是表示对该菌株的以下的条形图是表示对该菌株的GSH1/GSH2过量表达过量表达 ，ADP1的过量表达的过量表达和和ADP1/GSH1/GSH2 同时过量表达后同时过量表达后的的GSH产量与产量与原始菌株产原始菌株产GSH量进行比较量进行比较。GSH1/GSH2: 2.21 mg/lADP1: 3.47 mg / lADP1/ GSH1/ GSH2:11.4 mg /l分别是亲代菌株分别是亲代菌株GSH产量产量(1.

14、41 mg / l)的的1.6倍倍,2.5 倍倍 ,8.1倍倍总总产量产量GSH1/GSH2:亲代菌株亲代菌株浓度浓度 相相 同同ADP1:亲代菌株亲代菌株55% ADP1/ GSH1/ GSH2:亲代菌株亲代菌株47%细胞干重细胞干重ATP再生系统再生系统Ado：腺苷，腺苷，AMP:腺苷一磷酸腺苷一磷酸, Ino: 肌苷肌苷, Hx: 次黄嘌呤次黄嘌呤研究结果表明：较低的谷胱甘肽生产ATP再生系统的耦合不是因为ATP利用的低效率ATP再生的效率低。腺苷(Ado)转变成次黄嘌呤(Hx)不可逆转大肠杆菌JM109(pBV03),不能利用酿酒酵母WSH2 ATP再生的糖酵解途径。添加腺苷脱氨酶抑制剂块转换HX到Ado，ATP的数量再生是增加。因此,生产谷胱甘肽显著增加。结果将会扩大。LOGOLOGO添加腺苷脱氨酶对谷胱甘肽的影响添加腺苷脱氨酶对谷胱甘肽的影响在发酵过程中没有用添加前体的方式调控的在发酵过程中