免疫组化双重染色技术优秀课件

1、2021/3/291第八章第八章. 免疫组化双重染色技术免疫组化双重染色技术 (Double staining technology in immunohistochemistry)用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两用免疫组化方法在同一张组织切片上同时显示两种或两种以上的抗原种以上的抗原, 以发现其定位以发现其定位, 形态和功能上的相互关系形态和功能上的相互关系. 一一. 连续切片双重染色法连续切片双重染色法 A. 最简单最可靠最简单最可靠. 用同样的免疫组化方法用同样的免疫组化方法, 在两张相邻切在两张相邻切片上各显示一种抗原片上各显示一种抗原, 然后比较然后比较. 由于每张切

2、片上只进行由于每张切片上只进行一次染色一次染色, 所以不会互相干扰或出现假性双标记所以不会互相干扰或出现假性双标记. B. 切片厚度切片厚度13 m. 如果较厚如神经组织切片如果较厚如神经组织切片(1020 m), 可以采用可以采用“镜像镜像”法法, 即相邻切片翻转后贴在载玻片上即相邻切片翻转后贴在载玻片上, 或利用软件或利用软件PS. 2021/3/292二二. 免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: 用用不同的荧光色素不同的荧光色素标记标记不同的抗不同的抗体体, 染色后观察染色后观察, 相应的抗原物质显示不同的颜色相应的抗原物质显示不同的颜色. A. 直接法直接法: 1. 一步法一步法:

3、将将FITC (490495520530nm, 黄绿色荧光黄绿色荧光)和和TRITC (550620nm, 红色荧光红色荧光)分别标记的两种抗体按一定比例混分别标记的两种抗体按一定比例混合合, 使每个抗体均为最适稀释度使每个抗体均为最适稀释度, 然后孵育切片然后孵育切片. 2. 二步法二步法: 先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片先后依次使用两种荧光抗体分别孵育切片. 2021/3/2933. 观察观察: 同一个视野里同一个视野里.a. 对每一种荧光标记物对每一种荧光标记物(绿色或红色绿色或红色)使用不同的使用不同的滤色板滤色板进行进行观察和照相观察和照相, 每张照片显示一种荧光每张照片显示一

4、种荧光, 比较两张照片比较两张照片. b. 两种荧光重叠照相两种荧光重叠照相, 则在一张照片上可发现分别含不同抗则在一张照片上可发现分别含不同抗原的细胞原的细胞(呈绿色或红色呈绿色或红色), 如果两种抗原存在于同一个细胞如果两种抗原存在于同一个细胞或结构或结构, 则呈现两种红绿荧光的混合色则呈现两种红绿荧光的混合色, 如黄色如黄色. 免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: FITC绿色绿色, TRITC红色红色, 混合色为黄色混合色为黄色.2021/3/294B. 间接法间接法: 1. 两种一抗不标记两种一抗不标记, 但来自但来自不同种属的不同种属的动物如兔和豚鼠动物如兔和豚鼠. 2. 两种来

5、源于两种来源于同种动物或不同种动物或不同种动物同种动物的二抗的二抗(如羊抗兔如羊抗兔IgG和羊抗豚鼠和羊抗豚鼠IgG, 或羊抗或羊抗兔兔IgG和猪抗豚鼠和猪抗豚鼠IgG)分别以分别以FITC和和TRITC标记标记. 3. 染色程序染色程序:a. 先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片先用第一种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片, 显示第显示第一种抗原一种抗原; 然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育然后再用第二种一抗和相应的标记二抗依次孵育切片切片, 显示第二种抗原显示第二种抗原. b. 将两种一抗混合后孵育切片将两种一抗混合后孵育切片, 再将两种标记的二抗混合后再将两种标记的二抗混合后

6、孵育切片孵育切片, 最后用荧光显微镜观察最后用荧光显微镜观察. 2021/3/295免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: FITC绿色绿色, TRITC红色红色, 混合色为黄色混合色为黄色.2021/3/296Y.W Lin. USP26 stained by Alexa Fluor 488 and Myc stained by Alexa Fluor 594 in COS7 cells. Nuclei were stained by Hoechst blue2021/3/297三三. 免疫酶双重染色免疫酶双重染色A. 单酶法单酶法: 1. 原理原理: a. 用一种酶如用一种酶如 HRP标记

7、显示两种不同的抗原标记显示两种不同的抗原, 但用但用不同的不同的电子供体电子供体如如 DAB和和CN呈现不同颜色的反应终产物呈现不同颜色的反应终产物. b. 两种一抗两种一抗来自同种属动物来自同种属动物, 两重染色之间需将第一次两重染色之间需将第一次染色反应中的染色反应中的各级抗体和酶各级抗体和酶或或各级抗体各级抗体, 酶和反应产物酶和反应产物从组织上从组织上洗脱洗脱. c. 连续做两次染色连续做两次染色, 所费时间较长所费时间较长. 2021/3/298抗体抗体, 酶和反应产物洗脱酶和反应产物洗脱2021/3/2992. 染色的最佳条件染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色先对两种待检抗

8、原分别染色, 以决定合适的以决定合适的抗体稀释度和反应条件等抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序双重染色的先后次序: a. 先显示含量较少的抗原先显示含量较少的抗原. b. 先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原先显示容易受染色过程和洗脱过程影响的组织抗原.c. 先用不太敏感的抗体先用不太敏感的抗体.d. 先用先用DAB显色显色. 4. 对照试验对照试验: a. 单染对照单染对照.b. 在进行第二次染色前在进行第二次染色前, 要证明第一次染色的各级抗体和酶活要证明第一次染色的各级抗体和酶活性被完全除去性被完全除去, 而且洗脱后对第二个待检抗原无影响而且洗脱后对第二个待检抗原

9、无影响. 2021/3/29105. 抗体洗脱抗体洗脱:a. 酸洗法酸洗法: pH2.2甘氨酸甘氨酸-HCl缓冲缓冲液液(可加入适量二甲基甲酰胺可加入适量二甲基甲酰胺, DMF)14小时使抗原小时使抗原-抗体复合物抗体复合物解离解离. b. 氧化法氧化法: 2.5% KMnO4: 5% H2SO4: DDH2O=1:4:10260, 1分分, 氧化除去氧化除去抗体抗体, 0.5% Na2S2O5漂白液脱色漂白液脱色. 第一次染色用第一次染色用CN显色显色, 并注意对并注意对第二种抗原的影响第二种抗原的影响.c. 甲醛蒸气法甲醛蒸气法: 1升容器升容器+3g多聚多聚甲醛甲醛+切片切片, 置置80

10、烤箱烤箱14小时小时, 蒸汽破坏抗体的蒸汽破坏抗体的Ig结合部位结合部位.第一次用第一次用ABC法法, 氧化法洗脱抗体氧化法洗脱抗体. 对照试验证实此为假性双标对照试验证实此为假性双标.2021/3/29116. 具体操作步骤具体操作步骤: a. 方法方法1: 第一次染色后第一次染色后, 除去抗体和酶除去抗体和酶而使有色反应终产而使有色反应终产物留在抗原部位物留在抗原部位, 再用同样方法进行第二次染色再用同样方法进行第二次染色. *. 切片处理切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭同前抑制内源性酶及正常血清封闭同前. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色显色.

11、 TBS洗两次洗两次, 每每次次510分分. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱. TBS洗如上洗如上. *. 用用PAP法完成第二次染色法完成第二次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2显色显色. TBS洗如上洗如上. 甘油胶封片甘油胶封片. 2021/3/2912一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色一抗来自同种动物的单酶法免疫酶双重染色 2021/3/2913大鼠垂体前叶促性腺激素细胞大鼠垂体前叶促性腺激素细胞(蓝色蓝色)和生长激素细胞和生长激素细胞(棕色棕色), 免疫免疫酶酶(PAP法法)双重染色双重染色.2021/3/2914b. 方法方法2: 第一次染色后第一次染色后, 照相记录照相

12、记录结果并记住照相视野的部结果并记住照相视野的部位位. 用有机溶剂用有机溶剂将反应终产物溶解除去将反应终产物溶解除去, 并将第一次染色形成并将第一次染色形成的的抗体复合物洗脱掉抗体复合物洗脱掉, 然后进行第二次染色然后进行第二次染色. 对同一部位再一对同一部位再一次照相次照相, 比较先后照相所得照片比较先后照相所得照片. *. 切片处理同上切片处理同上. *. 用用PAP法完成第一次染色法完成第一次染色, CN-H2O2显色显色. TBS洗两次洗两次, 每次每次510分分. *. 以以TBS封片封片, 照相照相(注意随时从盖片边缘补加注意随时从盖片边缘补加TBS, 防止切片防止切片干燥干燥).

13、 *. 去盖片去盖片, TBS洗洗, 再用酒精再用酒精-二甲苯二甲苯-酒精处理酒精处理, 除去除去CN蓝色反蓝色反应产物应产物, DDH2O洗洗. *. 氧化法洗脱氧化法洗脱, 然后然后TBS洗两次如前洗两次如前. *. PAP法完成第法完成第2次染色次染色, 0.05%DAB-0.01%H2O2或或CN-H2O2显色显色. *. TBS洗同上洗同上, 封片封片. *. 找出第一次照相的部位找出第一次照相的部位, 再次照相再次照相. 2021/3/2915大鼠垂体前叶大鼠垂体前叶GnRH相关肽阳性细胞相关肽阳性细胞(左左, 蓝色蓝色)与促性腺激素细胞与促性腺激素细胞(右右, 棕色棕色)为同一种

14、细胞为同一种细胞, 免疫酶免疫酶(PAP法法)双重染色双重染色.2021/3/2916B. 双酶法双酶法: 1. 原理原理: a. 用两种无关的酶分别标记显示两种抗原用两种无关的酶分别标记显示两种抗原, 常用的酶为常用的酶为HRP和和AKP, 或或HRP和葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧化酶. b. 两种一抗来源于两种一抗来源于不同种属的动物不同种属的动物, 如兔和小鼠如兔和小鼠, 或同种动或同种动物物(如小鼠如小鼠)的两种的两种单克隆单克隆抗体抗体, 但其但其Ig亚类不同亚类不同, 如如IgGl和和IgG2a. c. 两种二抗分别是抗兔两种二抗分别是抗兔IgG和抗小鼠和抗小鼠IgG, 或抗小鼠或抗小鼠

15、IgGl和抗和抗小鼠小鼠IgG2a. 可以来自可以来自同种属动物或不同种属动物同种属动物或不同种属动物, 可以是可以是酶标抗体酶标抗体(一个用一个用HRP, 另一个用另一个用AKP标记标记), 也可以是未标记也可以是未标记抗体抗体(一个用兔一个用兔PAP, 另一个用小鼠另一个用小鼠APAAP).2021/3/2917c. 可避免抗体残留而引起的假性双标记可避免抗体残留而引起的假性双标记, 不需中间洗脱处理不需中间洗脱处理. 由由于无交叉反应于无交叉反应, 可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并可将两重染色的同一层抗体混合同时使用并先先后显示后显示两种酶的活性两种酶的活性, 在同一张切片上获得不

16、同颜色的反应终在同一张切片上获得不同颜色的反应终产物产物, 如棕色和蓝色如棕色和蓝色. 如两种抗原共存于同一个细胞如两种抗原共存于同一个细胞, 则出现灰则出现灰紫色的混合色紫色的混合色. 2021/3/29182. 染色的最佳条件染色的最佳条件: 先对两种待检抗原分别染色先对两种待检抗原分别染色, 以决定以决定合适的抗体稀释度和反应条件等合适的抗体稀释度和反应条件等. 3. 双重染色的先后次序双重染色的先后次序: 先显示先显示HRP, 再显示再显示AKP或葡萄糖或葡萄糖氧化酶氧化酶. 4. 对照试验对照试验: a. 单染对照单染对照.b. 必需排除两套抗体系统之间的必需排除两套抗体系统之间的交

17、叉反应交叉反应. 如第二种羊抗如第二种羊抗兔兔IgG二抗可能与第一种小鼠二抗可能与第一种小鼠IgG一抗结合而出现假性双一抗结合而出现假性双标记标记, 因此应事先做抗体进行交叉染色实验因此应事先做抗体进行交叉染色实验. 2021/3/29195. 染色步骤染色步骤: 以先后使用以先后使用PAP法和法和APAAP法为例法为例. a. 切片处理切片处理, 抑制内源性酶及正常血清封闭如前抑制内源性酶及正常血清封闭如前. b. 两种一抗混合液两种一抗混合液(各自稀释度由单染色决定各自稀释度由单染色决定), 室温室温30分或分或4过夜过夜. TBS洗两次洗两次, 每次每次510分分. c. 两种二抗混合液

18、两种二抗混合液(各自稀释度由单染色决定各自稀释度由单染色决定), 室温室温30分分. TBS洗同上洗同上. d. PAP和和APAAP混合液混合液(各自稀释度由单染色决定各自稀释度由单染色决定), 室温室温30分分. TBS洗同上洗同上. e. 显示显示HRP, 如用如用0.05%DAB-0.01%H2O2, 镜下控制染色镜下控制染色. TBS洗洗同上同上. f. 显示显示AKP, 如用萘酚如用萘酚AS-MX磷酸盐加固蓝磷酸盐加固蓝BB, 镜下控制染色镜下控制染色. TBS洗同上洗同上. g. 甘油胶封片甘油胶封片. 2021/3/29206. 注意事项注意事项: a. 过厚过厚切片切片(7

19、m)可能出现混合色可能出现混合色(双标记双标记)的假象的假象. b. APAAP法中缓冲液用法中缓冲液用TBS而不用而不用PBS, 或至少在显示酶或至少在显示酶活性的一步中用活性的一步中用TBS. c. 内源性内源性AKP一般不会引起问题一般不会引起问题. d. 正常血清封闭用两种二抗来源动物的正常血清正常血清封闭用两种二抗来源动物的正常血清. 四四. 免疫酶免疫酶-免疫荧光双重染色法免疫荧光双重染色法: 首先用免疫酶法显示首先用免疫酶法显示第一种抗原第一种抗原, 然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原然后用间接免疫荧光法定位第二种抗原. 若若两个一抗来自同一动物两个一抗来自同一动物, 需要注意可能发生的需要注意可能发生的交叉反应交叉反应.2021/3/2921五五. 免疫酶免疫酶-免疫金免疫金(银银)双重染色法双重染色法: A. 免疫酶免疫酶-免疫金双重染色法免疫金双重染色法: 1. 用用PAP法显示第一种抗原法显示第一种抗原, 为了加强与胶体金的红色为了加强与胶体金的红色的对比的对比, 用用CN显色显色(蓝色蓝色), 如该抗原存在于神经如该抗原存在于神经, 则用则用DAB显色显色. 2. 用酸洗法洗脱第一次染色的抗体复合物用