酶工程第四章

1、第四章第四章 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞v第一节第一节 概述概述v第二节第二节 固定化方法固定化方法v第三节第三节 固定化酶性质固定化酶性质v第四节第四节 固定化酶反应动力学固定化酶反应动力学v第五节第五节 固定化酶的应用固定化酶的应用一一 游离酶在应用中所存在的问题游离酶在应用中所存在的问题1 酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致应用生产成本高，而且应用过程难于连续化；应用生产成本高，而且应用过程难于连续化；此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。2 酶的稳定性一般较差，易受环境影响（物理酶的稳定性

2、一般较差，易受环境影响（物理因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至失活。失活。 第一节第一节 概述概述v二固定化酶概况二固定化酶概况 定义定义:凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。的酶。 发现发现：1916年年Nelson和和Griffin，骨粉吸附转化酶，骨粉吸附转化酶 研究：研究：1953年，年，Grubhofer和和Schloith，重氮化树酯，羧，重氮化树酯，羧肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶 工业化工业化：1969年千钿一郎，固定氨基酰化酶，年千钿一郎，固定

3、氨基酰化酶，D,L-氨氨基酸基酸 不溶于水不溶于水水不溶性酶，固相酶和固着酶水不溶性酶，固相酶和固着酶 1971年，第一届国际酶工程会议，年，第一届国际酶工程会议，“固定化酶固定化酶”名称名称三三 固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点优点优点 缺点缺点重复使用重复使用 载体昂贵载体昂贵产物易于分离产物易于分离 特性会发生改变特性会发生改变稳定性提高稳定性提高 部分酶活力丧失部分酶活力丧失连续加工连续加工 辅因子再生及多酶辅因子再生及多酶 反应存在问题反应存在问题v四四 固定化菌体固定化菌体 用一定的方法对菌体或菌体碎片进行固定，直接用一定的方法对菌体或菌体碎片进行固定，直接应用菌体或菌体碎片中的酶

4、或酶系进行催化反应。应用菌体或菌体碎片中的酶或酶系进行催化反应。 五五 固定化细胞固定化细胞 定义：凡限制在一定的空间范围内，并能连续定义：凡限制在一定的空间范围内，并能连续反复地使用的能进行生命活动细胞。反复地使用的能进行生命活动细胞。五五 固定化菌体或细胞的优缺点固定化菌体或细胞的优缺点优点优点 缺点缺点省去酶分离过程省去酶分离过程 细胞内蛋白酶对细胞内蛋白酶对辅因子再生及多酶反应辅因子再生及多酶反应 所需酶的分解所需酶的分解稳定性提高稳定性提高 副产物副产物 细胞壁和膜阻碍底物细胞壁和膜阻碍底物 111111111111111和产物的渗透、扩散和产物的渗透、扩散 1973年，日本在工业上

5、成功固定化大肠年，日本在工业上成功固定化大肠杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶，杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶，连续催化反丁烯二酸为连续催化反丁烯二酸为L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。第二节第二节 固定化方法固定化方法一固定化方法：一固定化方法：吸附法，吸附法，共价结合法，共价结合法，交联法，交联法，包埋法包埋法v二二 载体类型载体类型v1 来自于自然的有机载体来自于自然的有机载体v 优势优势:与酶有很好的相容性与酶有很好的相容性v 多糖类物质及其衍生物多糖类物质及其衍生物(多孔多孔,亲水亲水)v 纤维素及其衍生物纤维素及其衍生物(DEAE,CM)v 葡聚糖葡聚糖(Dextran)v 琼脂糖琼

6、脂糖(agarose)v 淀粉淀粉(starch)v 壳聚糖壳聚糖(chitosan)v 蛋白质蛋白质(明胶明胶gelatin ) v 2 无机载体无机载体v 优势优势:高压稳定性高压稳定性v 硅载体硅载体:多孔玻璃多孔玻璃;硅土硅土v 矿物原料矿物原料:粘土粘土,斑脱土斑脱土(火山火山灰分解成的一种粘土灰分解成的一种粘土)v3 无机合成载体无机合成载体v优势优势:化学及机械稳定性高化学及机械稳定性高v离子交换树脂离子交换树脂v 功能基团的共聚物功能基团的共聚物v三三 固定化方法固定化方法v1 吸附法吸附法:通过弱的相互作用吸附到硅土通过弱的相互作用吸附到硅土,粘土粘土,离离子交换树脂表面子交

7、换树脂表面,如离子键如离子键,氢键氢键,疏水作用力及静疏水作用力及静电等电等.1）物理吸附）物理吸附 定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂，活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂，将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。 优点：价廉，易操作易再生优点：价廉，易操作易再生 缺点：易泄漏，易受污染缺点：易泄漏，易受污染 静止法静止法 反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法 混合浴或振荡浴吸附法混合浴或振荡浴吸附法 例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附过氧

8、化氢皂土吸附过氧化氢酶酶, 淀粉酶淀粉酶; 纤维素粉吸附糖苷水解酶纤维素粉吸附糖苷水解酶; 火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄糖糖-6-磷酸脱氢酶。磷酸脱氢酶。v2）离子吸附）离子吸附 定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定化方法。化方法。 主要缺点：离子强度增加或者介质主要缺点：离子强度增加或者介质pH， 温度改温度改变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。v 3）疏水吸附）疏水吸附

9、 N烷基（疏水）琼脂糖烷基（疏水）琼脂糖 黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水性强）。性强）。v 4）亲和吸附）亲和吸附 伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A （利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）（利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）琼脂糖吸附糖蛋白。琼脂糖吸附糖蛋白。 5）螯合吸附）螯合吸附 利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。v2 包埋法包埋法v1）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。膜微胶囊中的方法。 该方法不需要化学修饰，反应条件温

10、和，适合该方法不需要化学修饰，反应条件温和，适合大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。v2）根据载体材料和方法的不同，可分为格子）根据载体材料和方法的不同，可分为格子型包埋法和微胶囊法。型包埋法和微胶囊法。 格子型包埋法格子型包埋法 常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶等。角叉菜胶，明胶等。 为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控制在小于酶分子直径的范围内。因而对于大分子底物的进制在小于酶分子直径的范围内。

11、因而对于大分子底物的进入和大分子产物的扩散出去不利。入和大分子产物的扩散出去不利。v微胶囊法（半透膜包埋法）微胶囊法（半透膜包埋法） 定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透性小球内，制成固定化酶。性小球内，制成固定化酶。 小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。v3 共价法共价法 定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。方法。 优点；稳定性好优点；稳定性好 缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件 苛刻，相对酶活力较

12、低。苛刻，相对酶活力较低。v 4交联法交联法 定义：借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作定义：借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。用，制成网状结构的固定化酶的方法。 第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的得到一种分子间交联的固定化酶固定化酶 双官能团能试剂：戊二醛，已二胺，顺丁烯二酸酐，双偶双官能团能试剂：戊二醛，已二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮氮苯氮氮苯 优点：结合牢固，可长时间使用优点：结合牢固，可长时间使用 缺点：交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒小，机械缺点：交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒

13、小，机械性能差，酶活性低。性能差，酶活性低。 常与吸附法或包埋法联合作用，制备出酶活性高，机械强常与吸附法或包埋法联合作用，制备出酶活性高，机械强度又好的固定化酶或固定化菌体度又好的固定化酶或固定化菌体。第三节第三节 固定化酶性质固定化酶性质一稳定性一稳定性储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在：储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在：1热稳定性，热稳定性，2蛋白质水解酶的抗性，蛋白质水解酶的抗性，3变性剂的耐变性剂的耐受性，受性，4保存期延长。保存期延长。二反应的最适温度二反应的最适温度 最适温度比天然酶高。最适温度比天然酶高。 用用CM-纤维素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜纤维素迭氮衍生物

14、固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比游离酶高蛋白酶的最适温度比游离酶高515。 采用不同固定化材料，最适温度不同，如氨基酰采用不同固定化材料，最适温度不同，如氨基酰化酶，天然酶最适温度化酶，天然酶最适温度60，分别用，分别用DEAE-葡葡聚糖凝胶、聚糖凝胶、DEAE-纤维素固定化的酶纤维素固定化的酶 的最适温的最适温度分别为度分别为72和和67。v三反应的最适三反应的最适pH1 载体性质载体性质2 产物性质产物性质微环境微环境最适最适pH载体（载体（-）吸引吸引H，pH偏高偏高载体（）载体（）吸引吸引OH-，pH偏低偏低微环境微环境最适最适pH产物（酸性）产物（酸性）pH偏高偏高产物（碱性）

15、产物（碱性）pH偏低偏低v 四四. 底物特异性底物特异性 底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底物的活性降低，对低分子量底物的反应速率变化不大。物的活性降低，对低分子量底物的反应速率变化不大。v 五酶活力五酶活力v 活力回收：固定化酶活力活力回收：固定化酶活力/溶液酶活力溶液酶活力;v 相对活力：固定化酶活力相对活力：固定化酶活力/溶液酶活力溶液酶活力-残留酶活力残留酶活力 酶经固定化后大部分活力下降！酶经固定化后大部分活力下降！v六六 米氏常数米氏常数Kmv固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数 随载体的带电性能随载体的带电

16、性能而变化。而变化。v固定化酶催化系统是一种非均相的反应系统。以固定化酶催化系统是一种非均相的反应系统。以微胶囊包埋法为例，反应过程包括微胶囊包埋法为例，反应过程包括:底物从反应底物从反应液主体移向载体表面液主体移向载体表面 (底物外部扩散底物外部扩散);从载体从载体表面移向酶、作用位点表面移向酶、作用位点 (底物内部扩散底物内部扩散);底物底物被催化生成产物被催化生成产物;产物从反应位点移向载体表产物从反应位点移向载体表面面;产物再移至反应主体液。产物再移至反应主体液。第四节第四节 固定化酶反应动力学固定化酶反应动力学一一 固定化对酶反应系统的影响固定化对酶反应系统的影响 1空间效应空间效应

17、 1)构象效应：酶在固定化过程中，由于存在酶和载体的相构象效应：酶在固定化过程中，由于存在酶和载体的相互作用，从而引起酶空间结构的改变，导致酶催化底物互作用，从而引起酶空间结构的改变，导致酶催化底物转化能力的改变。转化能力的改变。 2)位阻效应（空间障碍）：因载体的存在，给酶的活性位阻效应（空间障碍）：因载体的存在，给酶的活性部位或调节部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。部位或调节部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。2分配效应分配效应1）固定化酶和主体溶液组成）固定化酶和主体溶液组成固液非均相体系固液非均相体系微环境：微环境：固定化酶颗粒附近的环境固定化酶颗粒附近的环境宏观体系：主体溶液体系宏

18、观体系：主体溶液体系 2）分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏）分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶内部底物、其水性及静电作用等引起固定化酶内部底物、其他各种效应物（他各种效应物（H+, OH-离子，溶剂）以及产离子，溶剂）以及产物在微环境和宏观体系之间的不等分配，从而物在微环境和宏观体系之间的不等分配，从而影响酶反应速度的现象。影响酶反应速度的现象。3）分配效应动力学）分配效应动力学简化：简化： 假定酶被均匀地固定在载体表面，且整个反应系统假定酶被均匀地固定在载体表面，且整个反应系统充分搅拌，混合均匀，排除扩散效应。充分搅拌，混合均匀，排除扩散效应。荷电载体与

19、荷电溶质静电作用产生的分配效应常用分荷电载体与荷电溶质静电作用产生的分配效应常用分配系数表示配系数表示分配系数分配系数= Si/SSi：代表底物和其他各种效应物在微环境中的局部浓：代表底物和其他各种效应物在微环境中的局部浓度度S：代表底物和其他各种效应物在宏观体系中的总体：代表底物和其他各种效应物在宏观体系中的总体浓度浓度根据根据Boltzmann分配定律，荷电溶质在分配定律，荷电溶质在荷电载体微环境与外部溶液的分配服从分配系数可表示为：荷电载体微环境与外部溶液的分配服从分配系数可表示为：Si= S =exp-Ze/(KBT)其中，其中，Ze荷电溶质的电荷，荷电溶质的电荷，荷电载体产生的静电位

20、，荷电载体产生的静电位，KB为为Boltzmann 常数，常数，T 绝对温度绝对温度对固定化酶催化反应，分配效应仅影响底物浓度分对固定化酶催化反应，分配效应仅影响底物浓度分布，酶的动力学方程仍可用米氏方程表示。布，酶的动力学方程仍可用米氏方程表示。 V=Vm Si /(Km+ Si)= Vm S/(Km+S)= Vm S/(Kappm +S) 其中其中Kappm=Km/上式表明，分配效应造成的影响是改变上式表明，分配效应造成的影响是改变Km。= Si/S Kappm=Km/（1）当载体与底物电荷相同时，）当载体与底物电荷相同时，SiS，1， Kappm Km（2）当载体与底物电荷相反时，）当载

21、体与底物电荷相反时， Si S，1， KappmKm（3）上述效应，通过提高反应系统的离子强度，可减弱或消）上述效应，通过提高反应系统的离子强度，可减弱或消除除（4）采用疏水性载体，如果底物为极性物质或电荷性物质，）采用疏水性载体，如果底物为极性物质或电荷性物质，则则Si S，1， Kappm Km 如果底物为疏水性物质，则如果底物为疏水性物质，则Si S，1， KappmKm =exp-Ze/(KBT)其中，其中，Ze荷电溶质的电荷，荷电溶质的电荷，荷电载体产生的静电位，荷电载体产生的静电位，KB为为Boltzmann 常数，常数，T 绝对温度绝对温度分配效应对分配效应对H+和和OH-的影响

22、：的影响：H+和和OH-在载体内外也呈不等在载体内外也呈不等分布。分布。Hi+= H+exp-e/(KBT)-log Hi+ =-log H+exp-e/(KBT)pHi=pH+0.43 e/(KBT)pH= pHi -pH=0.43 e/(KBT) ln expx=xlog expx=-0.429xpHi微环境微环境 pH 宏观环境宏观环境阴离子载体： pH0v pH= pHi -pH=0.43 e/(KBT)3扩散效应扩散效应 底物产物和其他效应物在固定化酶载体内外之间的迁移底物产物和其他效应物在固定化酶载体内外之间的迁移扩散速度受到某种限制，造成了不等分布，从而影响反应扩散速度受到某种限

23、制，造成了不等分布，从而影响反应速度。扩散效应与这些物质的分子量大小，载体的结构及速度。扩散效应与这些物质的分子量大小，载体的结构及酶反应性质有关。酶反应性质有关。 外扩散：底物产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表外扩散：底物产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散。面间的扩散。 内扩散：在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应内扩散：在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散。物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散。外扩散效应动力学假定外扩散效应动力学假定1、惰性载体，不考虑分配效应的影响、惰性载体，不考虑分配效应的影响2、酶固定于液

24、体不能渗透的固体膜表面上，排除内扩散、酶固定于液体不能渗透的固体膜表面上，排除内扩散效应的干扰效应的干扰 反应过程：底物从溶液中移向膜表面，底物被酶催化为反应过程：底物从溶液中移向膜表面，底物被酶催化为产物，产物从膜表面移向溶液中。产物，产物从膜表面移向溶液中。v酶促反应速度酶促反应速度=VmSi/(Km+Si)v底物转移速度底物转移速度=Js(S-Si)Js : 底物转移系数底物转移系数当外扩散传质速率很快，固定化酶外表面当外扩散传质速率很快，固定化酶外表面反应速率相对较慢，并成为该反应过程速反应速率相对较慢，并成为该反应过程速率的控制步骤时，则率的控制步骤时，则Si=S,此时反应速率此时反

25、应速率:V=VmSi/(Km+Si) =Vm S/（Km+S）(2) 当外扩散传质速率很慢，固定化酶外表面当外扩散传质速率很慢，固定化酶外表面反应速率相对较快，此时外扩散速率成为反反应速率相对较快，此时外扩散速率成为反应的控制步骤，则应的控制步骤，则Si=0，此时反应速率为，此时反应速率为:V= Js(S-Si) =JsS当反应系统处于恒态时，酶促反应速度和底物传递速度相等。当反应系统处于恒态时，酶促反应速度和底物传递速度相等。V=Vm Si/(Km+Si) = Js(S-Si)当当Km Si时，则：时，则：Js(S-Si)= Vm Si/Km Si= JsS/ （Vm /Km+ Js）V=V

26、m Si/Km = S /（1/Js+ Km / Vm ）当当Js Vm /Km时，则：时，则： 1/Js Km / Vm V= Js S （外扩散限速）（外扩散限速）vThiele准数（西勒准数准数（西勒准数 ）v= Vm S/Km （酶促反应限速）（酶促反应限速）v Js S （外扩散限速）（外扩散限速）v = Vm /Kmv Jsv西勒准数西勒准数 反映了反映了外扩散效应对反应动力学的影响，代外扩散效应对反应动力学的影响，代表外扩散效应的大小。表外扩散效应的大小。v 越小，越小，扩散效应越小；扩散效应越小；v越小，越小，扩散效应越大；扩散效应越大；v固定化酶受外扩散因素的影响，当西勒准数

27、固定化酶受外扩散因素的影响，当西勒准数值为下列何种情况时，是酶促反应限速，发酵值为下列何种情况时，是酶促反应限速，发酵效果较好。效果较好。 v A、=0.1B、=2v C、=10D、=1004微扰效应：由于载体的亲水，疏水作用和微扰效应：由于载体的亲水，疏水作用和介电常数等性质，直接影响酶的催化能力介电常数等性质，直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力。或酶对效应物作出反应的能力。第五节第五节 固定化酶及细胞的应用固定化酶及细胞的应用v一酶在医学领域的应用一酶在医学领域的应用v尿激酶尿激酶 激活激活 溶纤维蛋白酶原溶纤维蛋白酶原 活性溶纤维蛋白酶活性溶纤维蛋白酶 溶解溶解纤维蛋白凝块纤维蛋白凝块v利用正常细胞含天冬酰胺合成酶而癌细胞缺乏利用正常细胞含天冬酰胺合成酶而癌细胞缺乏天冬酰胺合成酶天冬酰胺合成酶v天冬酰胺天冬氨酸天冬酰胺天冬氨酸天冬酰胺酶天冬酰胺酶n天冬酰胺合成酶天冬酰胺合成酶v二二 药用酶的范围药用酶的范围v、由于体内有害物质的积累所引起的疾病。、由于体内