实验三 病原细菌的鉴定与药物敏感性(大)

1、1 实验三实验三 病原细菌的分离、鉴定与毒力分析病原细菌的分离、鉴定与毒力分析 一、实验目的一、实验目的 1 1掌握无菌操作条件下致病菌的分离方法与程序；掌握无菌操作条件下致病菌的分离方法与程序； 2 2了解细菌鉴定的方法，熟悉细菌常用的生理生化反应及原理。了解细菌鉴定的方法，熟悉细菌常用的生理生化反应及原理。 2 二、实验内容二、实验内容 1. 1. 平板划线法分离病原细菌；平板划线法分离病原细菌； 2 2病原细菌的形态与生理生化鉴定；病原细菌的形态与生理生化鉴定； 3 3病原细菌的人工感染（课外选作实验）。病原细菌的人工感染（课外选作实验）。 3 三、主要仪器及试材三、主要仪器及试材 显微

2、镜，解剖镜，解剖用具，包括解剖盘、解剖刀、解剖针、大小手术剪、显微镜，解剖镜，解剖用具，包括解剖盘、解剖刀、解剖针、大小手术剪、 大小镊子，培养皿、载玻片、盖玻片、纱布等。大小镊子，培养皿、载玻片、盖玻片、纱布等。 蒸馏水、鱼用生理盐水，蒸馏水、鱼用生理盐水，70%70%的乙醇、的乙醇、BHIBHI培养基、生化管等。培养基、生化管等。 人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染的鱼人工感染嗜水气单胞菌的鱼，未知病原菌感染的鱼（剪掉部分背鳍或腹鳍（剪掉部分背鳍或腹鳍 作为标记作为标记) )。 4 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （一）（一） 病原细菌的分离病原细菌的分离 1 1无菌操作打开病

3、鱼的腹腔：无菌操作打开病鱼的腹腔： 2 2细菌划线接种：细菌划线接种： 3 3培养与观察：培养与观察： （二）病原细菌的革兰氏染色（二）病原细菌的革兰氏染色 分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和个人分离的未知菌株进行分别取嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、链球菌和个人分离的未知菌株进行 革兰氏染色，记录结果。革兰氏染色，记录结果。 5 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （三）病原细菌的生理生化鉴定（三）病原细菌的生理生化鉴定 分别测定分别测定分离菌分离菌和和嗜水气单胞菌嗜水气单胞菌的的1212种生化指标：氧化酶，吲哚实验，种生化指标：氧化酶，吲哚实验，VPVP， H H2 2S S，鸟

4、氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶性，七叶苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇，蔗糖，鸟氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶性，七叶苷，赖氨酸脱羧酶，山梨醇，蔗糖， 纤维二糖，明胶。纤维二糖，明胶。 取生化管于距离内容物上方取生化管于距离内容物上方2cm2cm处用砂轮割开，迅速于酒精灯火焰消毒，处用砂轮割开，迅速于酒精灯火焰消毒， 然后接种菌株，以然后接种菌株，以封口膜封口膜或液体石蜡封口，置或液体石蜡封口，置3535孵育，依据说明书进行。孵育，依据说明书进行。 6 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （四）病原细菌的毒力分析（四）病原细菌的毒力分析 1 1实验鱼：实验鱼：实验环境下暂养实验环境下暂养7-107-10天。

5、每组不少于天。每组不少于5050条条，设不少于，设不少于3 3个平行重复。个平行重复。 2 2菌悬液制备：菌悬液制备：液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经计数后采用等对数间距设计约液体培养基增殖，用无菌生理盐水悬浮。经计数后采用等对数间距设计约5 5 个感染剂量个感染剂量进行感染试验。对照组以无菌生理盐水。进行感染试验。对照组以无菌生理盐水。 3 3注射方法：注射方法：感染前实验鱼用感染前实验鱼用MS-222MS-222麻醉，用湿毛巾裹住鱼体头部。麻醉，用湿毛巾裹住鱼体头部。 （1 1）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。）腹腔注射：腹鳍基部无鳞片处。 （2 2）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区

6、域。）肌肉注射：背鳍前端与侧线之间的中部区域。 7 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （四）药物敏感性实验（四）药物敏感性实验 （一）纸片扩散法（一）纸片扩散法 1.1.原理：原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸 取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度递减的浓度梯度，细菌的生长被抑，细菌的生长被抑 制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈大，药制，形成透明的抑菌圈。抑

7、菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，即抑菌圈愈大，药 物敏感性越强。物敏感性越强。 8 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 2.2.实验操作实验操作 1 1）倒平板）倒平板 2 2）菌悬液制备：）菌悬液制备：挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到挑取斜面中菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将菌液浓度调到1 1* *107 107 cfu/mLcfu/mL。以玻璃刮铲将。以玻璃刮铲将0.1mL0.1mL细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面；细菌悬液均匀涂布于平皿培养基表面； 3 3）贴片：）贴片：将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片将镊子

8、于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片 与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有规律的与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了能准确观察结果，要求药敏片能有规律的 分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）；分布于平皿培养基上（在平皿中均匀贴四片）； 4 4）培养：）培养：2828温箱中培养温箱中培养24 h24 h，记录结果；，记录结果； 9 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系，观察抑菌圈的有无。若有抑菌结果观察：抑菌圈直径大小与药物浓度、细菌浓度有直接关系，观察抑菌圈

9、的有无。若有抑菌 圈，则测量抑菌圈直径；若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。圈，则测量抑菌圈直径；若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。 抑菌圈直径抑菌圈直径15mm 15mm 高度敏感高度敏感 抑菌圈直径抑菌圈直径10-15mm 10-15mm 中度敏感中度敏感 抑菌圈直径抑菌圈直径10mm 10mm 低度敏感低度敏感 无抑菌圈无抑菌圈 不敏感或耐药不敏感或耐药 氟：氟：7575g/mLg/mL；恩：；恩：5 5 g/mL g/mL 磺：磺：300300g/mLg/mL；青：；青：10IU/mL10IU/mL 10 磺磺氟氟 靑靑嗯嗯 12 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 （二）

10、肉汤试管稀释法（二）肉汤试管稀释法 1.1.原理：原理：以肉汤液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测定以肉汤液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后接入待检菌，定量测定 抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度（MICMIC）。）。 2.2.实验操作实验操作 1 1）菌液准备：）菌液准备：挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将挑取金黄色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理盐水中制成细菌悬液，将 菌液浓度调到菌液浓度调到1 1* *107cfu/mL107cfu/mL备用；备用； 13 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 2 2）抗菌

11、药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）：）抗菌药物稀释（硫酸庆大霉素注射液）：配制药物原液浓度为配制药物原液浓度为8 8万万IU/mLIU/mL（80mg/mL80mg/mL），）， 0.45 0.45 m m滤器除菌。滤器除菌。 准备准备1111支支2 mL2 mL无菌无菌EPEP管编号管编号010010排好，在排好，在0 0号管和号管和1 1号管中加号管中加1.8 mL1.8 mL无菌生理盐水，无菌生理盐水，210210号管加号管加1 mL1 mL； 吸取吸取0.2 mL0.2 mL药原液加入第一支药原液加入第一支EPEP管中混匀，从第一支试管中吸取管中混匀，从第一支试管中吸取0.2 mL0.2

12、mL加入第二支加入第二支EPEP管混匀，然后吸管混匀，然后吸 取取1 mL1 mL加入第三支混匀加入第三支混匀以此类推，直到第十一支；以此类推，直到第十一支； 取取1212支灭过菌的玻璃试管编号支灭过菌的玻璃试管编号1-121-12排好，各加入排好，各加入1.8mL1.8mL灭过菌的培养液，然后从编号相对应的灭过菌的培养液，然后从编号相对应的EPEP管中管中 吸取稀释过的药液再做吸取稀释过的药液再做1010倍比稀释。倍比稀释。 14 四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤 3 3）接种：）接种：每只试管中加入每只试管中加入0.1ml0.1ml的菌液；的菌液； 4 4）培养：）培养：置置3737温

13、箱，培养温箱，培养24h24h； 5 5）结果观察：）结果观察：肉眼观察，以不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌的肉眼观察，以不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌的MICMIC。 根据结果换算出最小抑菌浓度（根据结果换算出最小抑菌浓度（g/mLg/mL）。）。 8000 800 400 200 100 50 25 12.5 6.25 3.12 1.56 0.78 无菌生理盐水无菌生理盐水 1.8mL 0.2mL 抗生素抗生素 8万万/mL 下排培养液每管下排培养液每管 1.8mL 对应加对应加0.2mL 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.6 0.3 0.15

14、 00.8 16 五、实验注意事项五、实验注意事项 分离、接种时严格按照无菌操作要求进行。 分离、接种时严格按照无菌操作要求进行。 革兰氏染色过程中涂片务求均匀，切忌过厚，染色过程中不可使染液干涸。 革兰氏染色过程中涂片务求均匀，切忌过厚，染色过程中不可使染液干涸。 药敏实验，在贴片时用无菌镊子轻轻触压药物纸片，使之与培养基充分接触，贴片 药敏实验，在贴片时用无菌镊子轻轻触压药物纸片，使之与培养基充分接触，贴片 后不能再更改纸片位置；镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切后不能再更改纸片位置；镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切 勿镊起重新放置，以防不同抗生素

15、交叉影响。勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响。 17 六、实验安排六、实验安排 1-41-4节节 (1)(1)配培养基（固体、液体分装），包培养皿（配培养基（固体、液体分装），包培养皿（1010包），配制生理盐水，灭菌（包），配制生理盐水，灭菌（4 4瓶）；瓶）； (2)(2)完成细菌染色、观察和生化指标测定；完成细菌染色、观察和生化指标测定； 4-84-8节节 (1)(1)倒平板接种贴纸；倒平板接种贴纸；(2)(2)药液稀释接种；（药液稀释接种；（3 3）第二天早上看结果。）第二天早上看结果。 18 七、实验报告（一）七、实验报告（一） 1 1记录菌落特征、细菌形态、染色结果和生理生化结果（记录菌落特征、细菌形态、染色结果和生理生化结果（3030分）。分）。 2 2，据细菌形态特征和生化指标初步鉴定分离自患病鱼的细菌种类（，据细菌形态特征和生化指标初步鉴定分离自患病鱼的细菌种类（2020分